湯菊芬，黃 瑜，蔡 佳，廖建萌，黃月雄，簡紀常

( 1.廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088； 3.廣東省湛江市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 湛江 524022 )

鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)的藥代動力學和殘留消除規(guī)律研究

湯菊芬1,2，黃 瑜1,2，蔡 佳1,2，廖建萌3，黃月雄1,2，簡紀常1,2

( 1.廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088； 3.廣東省湛江市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 湛江 524022 )

在水溫(28±2) ℃、鹽度28 條件下，采用30 mg/kg的劑量口灌法，用HPLC-MS/MS檢測研究了鹽酸氯苯胍在體質(zhì)量為(350.15±5.18) g的眼斑擬石首魚體內(nèi)的藥代動力學和殘留消除規(guī)律。結(jié)果顯示，單劑量口灌給藥后，眼斑擬石首魚血漿中鹽酸氯苯胍的藥時數(shù)據(jù)符合一級吸收二室模型，藥物在血漿中的達峰時間、血藥質(zhì)量濃度峰值、藥時曲線下面積和消除半衰期分別為2.39 h、958.78 μg/L、33 247.57 μg/(L·h)和19.24 h；鹽酸氯苯胍在肌肉、肝臟和腎臟的血藥含量峰值分別為156.72、227.68 μg/kg和553.44 μg/kg，達峰時間分別為2.0、1.5、2.0 h；藥時曲線下面積分別4664.04、4897.74、17 228.19 μg/(kg·h)；消除半衰期分別為19.68、24.33、22.81 h。按30 mg/kg劑量連續(xù)5 d口灌給藥后，魚血漿、肌肉、肝臟、腎臟中的藥物消除半衰期(t1/2)分別為24.46、35.39、39.60、33.94 h。若以10 μg/kg為最高殘留限量，肌肉作為食用靶組織，在本試驗條件下，建議休藥期不少于7 d。

鹽酸氯苯胍；眼斑擬石首魚；藥代動力學；殘留消除

眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)，屬鱸形目、石首魚科、擬石首魚屬，原產(chǎn)于美國東海岸和墨西哥灣。該魚生長迅速，條件適宜時飼養(yǎng)一年即可達到1 kg 以上的商品規(guī)格，肉質(zhì)鮮美，抗病害能力強，是優(yōu)良的海水養(yǎng)殖種類。我國于1991 年由國家海洋局第一海洋研究所引進其稚魚，人工育苗獲得成功，現(xiàn)已大規(guī)模地投入生產(chǎn)。但近年來由于養(yǎng)殖密度的不斷增大，水環(huán)境條件惡化，微孢子蟲病害頻發(fā)，給眼斑擬石首魚的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失，目前尚未發(fā)現(xiàn)有良好治療該疾病的藥物。

鹽酸氯苯胍是一種廣譜、高效、低毒，安全、適口性好的抗球蟲藥，主要影響三磷酸腺苷而干擾球蟲蛋白質(zhì)代謝。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)病害的頻發(fā)，人們發(fā)現(xiàn)鹽酸氯苯胍對養(yǎng)殖魚類的孢子蟲病有一定的防治效果[1-2]。而目前，國內(nèi)外對鹽酸氯苯胍的研究大多集中在對家禽等動物藥物殘留的檢測方法上[3-8]，對其在水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥代動力學和殘留消除的研究尚未見報道。本試驗研究了鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)的藥代動力學和殘留消除規(guī)律，為鹽酸氯苯胍在魚類寄蟲病害防治中的應用及規(guī)范用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚購自湛江市南三島某魚排，在廣東海洋大學東海島實驗基地用不含任何藥物的配合飼料暫養(yǎng)1周，預先檢測確認魚體內(nèi)無鹽酸氯苯胍殘留。挑選健康、規(guī)格整齊，體質(zhì)量為(350.15±5.18) g的魚作為試驗魚。

鹽酸氯苯胍標準品純度為98.5%(美國JK公司)；色譜級甲醇(天津四友精細化學品有限公司)；色譜級甲酸(廣東光華科技股份有限公司)；乙酸、無水硫酸鈉等均為分析純(國藥集團上?；瘜W試劑有限公司)；水為超純水。

試驗儀器：液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有ESI源，美國Thermo Fisher公司)；XS-205電子分析天平(METTLER-TOLEDO公司)；德國IKA-T25均質(zhì)機(上海珂淮儀器有限公司)；Sartorius arium-611VF超純水機(上海摩速科學器材有限公司)；HR2860高速勻漿機(荷蘭皇家飛利浦電子公司)；XW-80A漩渦混勻器(上海比朗儀器有限公司)；HU3120B超聲波清洗器(海比朗儀器有限公司)；TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；N-EVAP111氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸氯苯胍標準溶液配置

準確稱取鹽酸氯苯胍標準品10 mg(精確至0.0001 g)，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL標準溶液，再用甲醇稀釋100倍，成質(zhì)量濃度10 μg/mL的標準儲備液，冰箱中-4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

準確量取10 μg/mL鹽酸氯苯胍標準儲備液，用甲醇∶水=1∶1(體積比)分別稀釋成質(zhì)量濃度為0、1、2、5、10、20、50、100 ng/mL共8個質(zhì)量濃度的標準工作液。

1.2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

參照文獻[9]，洗脫程序和質(zhì)譜條件見表1和表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 鹽酸氯苯胍的保留時間和質(zhì)譜條件

1.2.3 給藥及樣品采集

藥物代謝組：將停飼24 h的眼斑擬石首魚隨機分成15個組(與采樣時間點對應)，每組10尾置于一個0.3 m3的玻璃鋼桶中，另取數(shù)尾魚作為空白對照組。鹽酸氯苯胍按30 mg/kg劑量口灌試驗魚，于給藥后的第0.15、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h和120 h取樣，每組取5尾魚，尾靜脈采血后快速取其肝臟、腎臟和背部的肌肉樣品適量。每尾魚血液分別置于用肝素鈉處理過的離心管中，5000 r/min離心8 min，提取上清液于離心管中冰箱-20 ℃保存。肝臟、腎臟、肌肉分別置于無菌離心管中, 在冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

殘留消除組：眼斑擬石首魚隨機分成7個組，每組10尾，按30 mg/kg劑量連續(xù)5 d口灌鹽酸氯苯胍，分別在最后一次給藥后0.5、1、2、3、5、7 d和10 d采樣，采樣方法同藥物代謝組。

1.2.4 樣品處理

參照文獻[4-5]稍加修改：血漿和各組織在室溫下自然解凍，取1 mL血漿或適量組織樣品(肌肉和肝各2.0 g、腎臟0.2 g，剪碎)置于50 mL離心管中，依次加入5 mL甲醇(含1%甲酸，體積比)和4 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩，超聲15 min，4000 r/min離心10 min，吸取上清液。重復上述操作一次，合并上清液于50 mL離心管中，在40 ℃水浴中用氮氣吹干。用5.0 mL甲醇溶解殘渣，渦旋振蕩，超聲15 min，4000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液待上機檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003處理藥時數(shù)據(jù)，模型的擬合和參數(shù)推算用DAS 3.0軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚各組織中的藥時曲線

眼斑擬石首魚按30 mg/kg口灌鹽酸氯苯胍后，藥時曲線見圖1。由圖1可見，各組織中的藥時曲線均呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，血漿、肌肉、肝臟、腎臟中的兩次出峰時間分別為2 h、12 h，2 h、12 h，1.5 h、8 h，2 h、12 h，兩次血藥含量峰值分別為1227.07 μg/L、1036.58 μg/L，156.72 μg/kg、115.88 μg/kg，227.68 μg/kg、186.83 μg/kg，553.44 μg/kg、499.45 μg/kg。

2.2 鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首血漿中的藥代動力學參數(shù)

經(jīng)DAS 3.0軟件分析，鹽酸氯苯胍血漿的藥時數(shù)據(jù)符合一級吸收二室模型，理論方程為：C口灌=16 822.78e-1.54t+1245.30e-0.036t-18 068.08e-1.42t，其藥動學參數(shù)見表3。

2.3 鹽酸氯苯胍在美國紅魚組織中的藥代動力學參數(shù)

用統(tǒng)計矩原理推算出鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)組織中的藥動學參數(shù)(表4)。血藥含量峰值和藥時曲線下面積腎臟>肝臟>肌肉，平均駐留時間肝臟>腎臟>肌肉，消除半衰期肝臟>腎臟>肌肉。說明鹽酸氯苯胍主要分布在腎臟中，藥物在肝臟中的平均駐留時間最長，其消除半衰期也高于腎臟和肌肉。

圖1 眼斑擬石首魚口灌鹽酸氯苯胍后血漿和組織中的藥時曲線

參數(shù)口灌給藥分布相的零時截距/mg·L-116822.781分布速率常數(shù)/h-11.536消除相的零時截距/mg·L-11245.305消除速率常數(shù)/h-10.036藥物吸收速率常數(shù)/h-11.416分布相半衰期/h0.451消除相半衰期/h19.241吸收半衰期/h0.489表觀分布容積/L13.995總清除率/L·h-12.378藥物自中央室的消除速率/h-10.397藥物自中央室到周邊室的一級運轉(zhuǎn)速率/h-11.036藥物自周邊室到中央室的一級運轉(zhuǎn)速率/h-10.139藥時曲線下面積(0～72h)/μg·(L·h)-133247.57藥時曲線下面積(0～∞h)/μg·(L·h)-133623.031達峰時間/h2.39峰質(zhì)量濃度/mg·L-1958.78

表4 眼斑擬石首魚口灌鹽酸氯苯胍后組織中的藥代動力學參數(shù)

2.4 鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)的消除

眼斑擬石首魚按30 mg/kg劑量連續(xù)5 d口灌鹽酸氯苯胍后，藥時數(shù)據(jù)用Excel 2003回歸處理后得到藥物含量與時間的消除曲線方程及相關(guān)參數(shù)(表5)，藥物的消除曲線見圖2。由圖2和表5可見，鹽酸氯苯胍在不同組織中的殘留量依次為血漿>肝臟>腎臟>肌肉。不同組織中的消除半衰期依次為肝臟>肌肉>腎臟>血漿, 說明鹽酸氯苯胍在肝臟中消除最慢。

表5 眼斑擬石首魚體口灌鹽酸氯苯胍后血漿和組織中的消除曲線方程及參數(shù)

3 討 論

3.1 鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚血漿和組織中的藥時曲線和藥代動力學特征

以30 mg/kg單劑量口灌鹽酸氯苯胍后，眼斑擬石首魚血漿和組織中的藥時曲線出現(xiàn)明顯的雙峰現(xiàn)象。目前，關(guān)于口服藥物藥時曲線的雙峰現(xiàn)象研究報道較多，認為其主要原因是肝腸循環(huán)和非齊性吸收所致，兩峰相隔時間2～20 h[10-11]。藥物進入十二指腸后，可在小腸重吸收返回肝臟，形成肝腸循環(huán)，引起雙峰現(xiàn)象?？诜幬镞M入體內(nèi)時，要經(jīng)過胃腸道上、下兩個部位的吸收，不同部位和管壁對藥物的通透性不同，也可導致雙峰現(xiàn)象[12]。

目前國內(nèi)外尚未有鹽酸氯苯胍作為驅(qū)蟲漁藥及在水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥代動力學研究報道，在其他動物體內(nèi)的藥代動力學研究也極為鮮見。本試驗在水溫(28±2) ℃、鹽度28條件下，鹽酸氯苯胍按30 mg/kg的劑量口灌后，眼斑擬石首魚血漿中的藥時數(shù)據(jù)符合一級吸收二室模型，血漿、肌肉、肝臟、腎臟中的藥物含量均在約1.5 h出現(xiàn)第一次峰值，血藥含量峰值分別為211.38 μg/L、37.58 μg/kg、863.02 μg/kg、1063.24 μg/kg，藥時曲線下面積分別為5229.16 μg/(L·h)、1017.03 μg/(kg·h)、20 841.20 μg/(kg·h)、30 743.04 μg/(kg·h)。說明口灌給藥，鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)吸收較為緩慢，在肝臟和腎臟中分布較多，血漿、肌肉中分布較少。

圖2 眼斑擬石首魚按30mg/kg劑量連續(xù)5 d口灌鹽酸氯苯胍后血漿和組織中藥物的消除曲線

消除半衰期和平均駐留時間是反映藥物在動物體內(nèi)消除速度的重要參數(shù)。眼斑擬石首魚單劑量口灌鹽酸氯苯胍后，消除半衰期分別為血漿(46.99 h)>肌肉(26.35 h)>腎臟(24.31 h)>肝臟(14.05 h)，平均駐留時間分別為血漿(129.72 h)>肌肉(41.29 h)>腎臟(39.19 h)>肝臟(27.62 h)。消除半衰期和平均駐留時間反映藥物在血漿和組織中消除、駐留時間快慢順序一致，說明鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體血漿和肌肉中消除較為緩慢、駐留時間較長。

3.2 連續(xù)口灌給藥后鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)的殘留、消除及休藥期

眼斑擬石首魚連續(xù)5 d口灌給藥后，組織中的藥物殘留量腎臟>血漿>肝臟>肌肉。血漿和組織中的藥物消除半衰期分別為肌肉(46.14 h)>肝臟(36.11 h)>腎臟(28.62 h)>血漿(26.92 h)，表明鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)消除較為緩慢，肌肉中的消除最慢，與班付國等[13]的研究結(jié)果基本一致，但鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)的消除速度比氯苯胍在雞體內(nèi)的消除慢，可能與研究對象對藥物的代謝速度不同有關(guān)。

目前，中國、歐盟及美國等多個國家和地區(qū)都制訂了氯苯胍在動物源食品中的最高殘留限量。農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布第235號公告中規(guī)定，鹽酸氯苯胍在雞脂肪、皮、可食組織中的最高殘留限量分別為200、200、100 μg/kg[14]。中國和歐盟等國家和地區(qū)對水產(chǎn)品中鹽酸氯苯胍暫無明確的殘留限量要求。根據(jù)日本2006年實施的食品中農(nóng)業(yè)化學品殘留“肯定列表制度”，要求對于未制定最大殘留限量標準的農(nóng)業(yè)化學品在食品中含量不得超過0.01 mg/kg，對于已建立最高殘留限量標準的化學物質(zhì)則在食品中含量不得超過最高標準[15]。本研究將鹽酸氯苯胍的最高殘留限量暫定為0.01 mg/kg，以肌肉作為食用靶組織。在停藥后第5 d，肌肉中的藥物殘留量為2.57 μg/kg，低于設(shè)定的最大殘留限量(0.01 mg/kg)，考慮本試驗未檢測皮膚中的藥物含量，為充分保證消費者的安全，應將休藥期適當延長。因此，在本試驗條件下，建議鹽酸氯苯胍在眼斑擬石首魚體內(nèi)休藥期至少為7 d。

[1] 吳仕輝，陳昆慈，戴曉欣，等．分散固相萃取/高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中氯苯胍的殘留量[J]．分析測試學報，2011，30(12):1356-1361．

[2] 楊先樂，陸承平，戰(zhàn)文斌，等．新編漁藥手冊[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：204-241．

[3] 李俊玲，劉學江，徐強，等．飼料中鹽酸氯苯胍的測定[J]．飼料廣角，2003(15)：20-23．

[4] 劉勇軍，吳銀良，姜艷彬．高效液相色譜法測定雞組織與雞蛋中的鹽酸氯苯胍的殘留量[J]．色譜，2010，28(9)：905-907．

[5] 莫金杰，劉娟，胡玉霞，等．HPLC法測定鹽酸氯苯胍原粉含量[J]．畜牧市場，2011(2)：19-20．

[6] Kot-Wasik A, Wasik A. Determination of robenidine in animal feeds by liquid chromatography coupled with diode-array detection and mass spectrometry after accelerated solvent extraction[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 543(1):46-51.

[8] Olejnik M, Szprengier-Juszkiewicz T, Jedziniak P. Multi-residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2009,1216(46):8141-8148.

[9] 湯菊芬，蔡佳，廖建萌，等．HPLC-MS/MSi法測定水產(chǎn)品中的諾氟沙星、鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍殘留量[J]．中國獸藥雜志，2014，48(8):55-60．

[10] Kroboth P D, Smith R B, Rault R, et al. Effects of end-stage renal disease and aluminum hydroxide on temazepam kinetics[J]. Clinical Pharmacology and Therapeutics,1985, 37(4):453-459.

[11] Pentikainen P J, Neuvonen P J, Penttila A. Pharmaeokinetics and pharmaeodynamics of glipizide in healthy volunteers[J]. Int J Clin Pharmacol Ther Toxieol, 1983, 21(2):98-107.

[12] Feng J, Xu W, Tao X, et al. Simultaneous determination of baicalin, baicalein, wogonin, berberine, palmatine and jatrorrhizine in rat plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and application in pharmacokinetic studies after oral administration of traditional Chinese medicinal preparations containing scutellaria-coptis herb couple[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 53 (3):591-598.

[13] 班付國，吳寧鵬，李慧素，等．氯苯胍在雞組織中的殘留消除規(guī)律研究[J]．中國獸藥雜志，2012，46(11):24-26．

[14] 動物性食品中獸藥最高殘留限量(農(nóng)業(yè)部2002年235號公告)[J]．中國豬業(yè)，2010(8):10-12．

[15] 吳曉峰，沈毅誠，孫蓓玲. 日本“肯定列表制度”我國出口水產(chǎn)品面臨的嚴峻挑戰(zhàn)[J]．中國動物檢疫，2006，23(6):49-50．

PharmacokineticsandEliminationofRobenidineHydrochlorideResiduesinRedDrumSciaenopsocellatus

TANG Jufen1,2, HUANG Yu1,2, CAI Jia1,2, LIAO Jianmeng3, HUANG Yuexiong1,2, JIAN Jichang1,2

( 1.Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, Zhanjiang 524088, China; 3.Guangdong Zhanjiang Institute of Supervision and Test on Quality and Measure, Zhanjiang 524022, China )

The pharmacokinetics and elimination regularity of robenidine hydrochloride (ROBH) residues were investigated in plasma and tissues of red drumSciaenopsocellatuswith body weight of (350.15±5.18) g orally administrated at a single dose of 30 mg/kg body weight at water temperature of (28±2) ℃ and salinity of 28 by HPLC-MS/MS method. Results showed that ROBH concentration-time data in plasma of red drum was described as a two-compartment model with first-order absorption after a single dose of oral administration, with the peak time (tp) of 2.39 h, the maximum concentration (Cmax) of 958.78 μg/L, the area under the concentration-time curve (AUC0—∞) of 33 247.57 μg/(L·h) and the elimination hal-life (tl/2β) of 19.24 h in plasma. The findings indicated that ROBH in red drum had the ability to be distributed widely in diverse tissues and that ROBH residues were eliminated slowly. TheCmaxwas found to be 156.72 μg/kg in muscle, 227.68 μg/kg in liver and 553.44 μg/kg in kidney, andtpwas 2.0 h in muscle, 1.5 h in liver and 2.0 h in kidney. AUC0—∞were shown to be 4664.04 μg/(kg·h) in muscle, 4897.74 μg/(kg·h) in liver and 17 228.19 μg/(kg·h) in kidney, withtl/2βof 19.68 h in muscle, 24.33 h in liver and 22.81 h in kidney. Thet1/2was 24.46 h in plasma, 35.39 h in muscle, 39.60 h in liver and 33.94 h in kidney in red drum with oral continuous administration at a dose of 30 mg/kg for 5 days. If the maximum residue limits (MRLs) was considered as 0.01 mg/kg and the muscles as edible target tissue, the withdrawl period should be over 7 days under this experiment condition.

robenidine hydrochloride;Sciaenopsocellatus; pharmacokinetics; residue

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.015

S943.339

A

1003-1111(2017)04-0493-05

2016-08-24；

2016-10-14.

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(20120385)；廣東省科技計劃(農(nóng)村科技領(lǐng)域)項目(2015A020209181)．

湯菊芬(1964—)，女，高級工程師，碩士；研究方向：水產(chǎn)動物病害防治．E-mail：tjf10002000@163.com. 通訊作者：簡紀常(1964—)，男，教授，博士；研究方向：魚類分子免疫學．E-mail：jianjc@gmail.com.