王宏偉，楊麗坤，趙文博，李林鋒，邢清朝，謝恒輝

( 1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002； 2.天津武清區(qū)楊村一中，天津 300000 )

諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響

王宏偉1，楊麗坤1，趙文博1，李林鋒1，邢清朝1，謝恒輝2

( 1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002； 2.天津武清區(qū)楊村一中，天津 300000 )

在沉積物中均勻加入諾氟沙星，模擬研究了沉積物中諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺不同組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響。結(jié)果表明，諾氟沙星的處理使中國(guó)圓田螺各組織中的氨基比林-N-脫甲基酶活性發(fā)生了變化，不同和相同含量諾氟沙星對(duì)同種或不同組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性的影響不同?？偟内厔?shì)為：低含量諾氟沙星對(duì)肝、腎、胃等組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為前期誘導(dǎo)后期抑制；中、高含量諾氟沙星抑制腎、胃等組織氨基比林-N-脫甲基酶活性；諾氟沙星一直抑制卵巢和肌肉組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性。

中國(guó)圓田螺；諾氟沙星；氨基比林-N-脫甲基酶活性

諾氟沙星屬于氟喹諾酮類抗菌藥，近年廣泛用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害[1]，但殘留物對(duì)環(huán)境的影響不可忽略，尤其是沉積物對(duì)底棲生物造成影響[2]。這些殘留物經(jīng)過(guò)生物濃縮、生物放大等作用及食物鏈傳遞對(duì)人類健康也會(huì)有影響。中國(guó)圓田螺(Cipangopaludinachinensis)，俗稱螺螄、田螺，是中國(guó)各淡水水域的底棲生物，很多人喜食，對(duì)環(huán)境具有指示作用，但相應(yīng)的研究工作很少。本試驗(yàn)?zāi)M中國(guó)圓田螺的生存環(huán)境，研究了沉積物中不同含量諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺肝、腎、胃、卵巢以及肌肉5種組織器官的藥物代謝Ⅰ相酶氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響[3]，以期探討諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺代謝的影響，為評(píng)價(jià)水產(chǎn)品對(duì)人類健康的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中國(guó)圓田螺取自河北白洋淀，平均質(zhì)量(5.89±1.75) g，殼高(31.40±5.08) mm，殼寬(18.81±1.88) mm，試驗(yàn)前中國(guó)圓田螺暫養(yǎng)3 d，以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。取12個(gè)2 L白瓷缸，每個(gè)缸放入經(jīng)高錳酸鉀溶液消毒過(guò)的細(xì)沙200 g，同時(shí)加入根據(jù)文獻(xiàn)[4]中諾氟沙星的環(huán)境含量范圍配制的諾氟沙星母液，按諾氟沙星與沉積物(細(xì)沙)質(zhì)量比分別為0 μg/g(空白對(duì)照組)、500 μg/g(低含量組)、1000 μg/g(中含量組)、1500 μg/g(高含量組)配制，每組3個(gè)平行。沿缸壁加曝氣水至150 mL，將其靜止24 h后，每個(gè)缸內(nèi)加入中國(guó)圓田螺10只。試驗(yàn)過(guò)程中，水溫(23±1) ℃，pH 7.0～7.2，溶解氧10.1～10.3 mg/L。在試驗(yàn)的第2、4、6、8、10 d分別測(cè)定各組螺肝、腎、胃、卵巢、肌肉5個(gè)組織中的氨基比林-N-脫甲基酶活力。測(cè)定各組螺肝、腎、胃、卵巢、肌肉5個(gè)組織中氨基比林-N-脫甲基酶活力時(shí)，各采3只螺(即每個(gè)平行取1只)，作為平行樣本，以減少誤差。解剖中國(guó)圓田螺，分別在肝、腎、胃、卵巢、肌肉等部位用解剖針和剪刀取10 μg組織，放入研缽中(4 ℃預(yù)冷)，加入990 μL蒸餾水[5]，研碎，制成1∶100(m/V)的組織勻漿，吸入1.5 mL離心管，4 ℃，3000 r/min離心10 min，取上清液。試驗(yàn)用酶標(biāo)儀(普朗醫(yī)療器械公司)，諾氟沙星純度高于98%(天津市化學(xué)試劑一廠)，氨基比林-N-脫甲基酶測(cè)定試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。

1.2 氨基比林-N-脫甲基酶活力測(cè)定

氨基比林-N-脫甲基酶活性的酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定：加樣參照表1。用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜止1 min，甩去洗滌液，吸水紙上排干，重復(fù)洗板5次(表1)。15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值(表2)。

表 1 氨基比林-N-脫甲基酶活力測(cè)定試劑盒加樣量及測(cè)定過(guò)程 μL

表2 不同含量標(biāo)準(zhǔn)品的OD值

氨基比林-N-脫甲基酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：根據(jù)表2操作測(cè)得120、60、30、15、7.5、0 U/L標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品含量作為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線(圖1)。

圖1 氨基比林-N-脫甲基酶標(biāo)準(zhǔn)品曲線

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果為3次測(cè)定值的平均值，數(shù)據(jù)誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示處理組與對(duì)照組差異顯著，用*表示。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶的測(cè)定結(jié)果

中國(guó)圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的變化見圖2。由圖2可知，除低含量組(500 μg/g)第4、6 d和8 d外，其他試驗(yàn)組均表現(xiàn)出顯著性差異，暴露第2 d時(shí)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高；第4 d時(shí)低含量組無(wú)顯著差異，中含量組(1000 μg/g)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，高含量組(1500 μg/g)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降；第6、8 d時(shí)，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性無(wú)顯著變化，中、高含量組活性顯著下降；第10 d時(shí)，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，另外兩試驗(yàn)組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降。這種變化表明，低含量諾氟沙星處理前期誘導(dǎo)肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性，中期影響不大；而中、高含量諾氟沙星在處理前期誘導(dǎo)氨基比林-N-脫甲基酶活性，后期表現(xiàn)為抑制，含量越高誘導(dǎo)作用持續(xù)時(shí)間越短。

圖2 中華圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化*表示與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05).余同.

2.2 腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶的測(cè)定結(jié)果

中國(guó)圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化見圖3。由圖3可知，低含量諾氟沙星暴露組第4 d時(shí)，中國(guó)圓田螺腎中氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，第8 d時(shí)，氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，其余時(shí)間段無(wú)顯著影響。中含量諾氟沙星組除第8 d 氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著受抑制外，其余時(shí)間均為顯著誘導(dǎo)。高含量諾氟沙星組暴露第2 d和6 d時(shí)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高，其余時(shí)間則顯著下降。這表示低含量諾氟沙星組腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性作用表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制；中含量諾氟沙星組影響的總趨勢(shì)為抑制作用；而高含量諾氟沙星組的作用與低含量組相似，呈先誘導(dǎo)后抑制。

2.3 胃組織氨基比林-N-脫甲基酶的測(cè)定結(jié)果

諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響見圖4。由圖4可知，暴露第2 d時(shí)，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性上升，其余組氨基比林-N-脫甲基酶活性下降；第4 d時(shí)，低、中含量組酶活性上升，高含量組顯著下降；第6 d時(shí)，低、中含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，高含量組無(wú)明顯變化，第8 d時(shí)，各含量組酶活性達(dá)到峰值，各試驗(yàn)組中氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降；第10 d時(shí)，試驗(yàn)組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著高于對(duì)照組, 表明低含量諾氟沙星對(duì)胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為先誘導(dǎo)后抑制，高、中含量組對(duì)氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為抑制。

圖3 中國(guó)圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

圖4 中國(guó)圓田螺胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

2.4 卵巢組織中氨基比林-N-脫甲基酶活性的測(cè)定結(jié)果

諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺卵巢組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性變化見圖5。由圖5可知，低含量諾氟沙星組在暴露第2、4、10 d時(shí)，氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，第6、8 d時(shí)氨基比林-N-脫甲基酶含量顯著高于對(duì)照組；中含量諾氟沙星組處理第2 d氨基比林-N-脫甲基酶活性無(wú)顯著變化；第4 d酶活性顯著上升，其余時(shí)間顯著下降；高含量組除第10 d酶活性的受限制程度高于對(duì)照組，其他時(shí)間均顯著低于對(duì)照組，表明諾氟沙星對(duì)氨基比林-N-脫甲基酶活性均表現(xiàn)為抑制作用。

圖5 中國(guó)圓田螺卵巢組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

2.5 肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶的測(cè)定結(jié)果

諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺肌肉組織中氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響見圖6。由圖6可知，第2、4 d時(shí)各個(gè)試驗(yàn)組氨基比林-N-脫甲基酶活性均低于對(duì)照組。第6、8 d時(shí)低含量組肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶活性無(wú)明顯影響，中含量組在第6 d時(shí)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著高于對(duì)照組，第8 d時(shí)低于對(duì)照組；高含量組則相反；第10 d時(shí)，低、中含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著低于對(duì)照組，高含量組則高于對(duì)照組。這表明諾氟沙星對(duì)肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為抑制作用。

3 討 論

低含量短時(shí)間的暴露處理使中國(guó)圓田螺肝臟中的氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高，對(duì)氨基比林-N-脫甲基酶表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，這與Li 等[5]的試驗(yàn)研究結(jié)果相似，而接下來(lái)的幾天與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異，這與其他研究結(jié)果不太一致，可能是由于中國(guó)圓田螺的機(jī)體適應(yīng)能力所致；當(dāng)暴露第10 d時(shí)酶的活性顯著上升，說(shuō)明低含量的諾氟沙星可使中國(guó)圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性升高，進(jìn)而使其有更高的藥物代謝功能；中含量與高含量的諾氟沙星暴露試驗(yàn)過(guò)程中分別在第6 d和第4 d以后顯示出對(duì)氨基比林-N-脫甲基酶的抑制作用，這種結(jié)果說(shuō)明諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性具有抑制作用，且這種抑制作用存在一定的時(shí)間和劑量效應(yīng), 這可能與藥物含量高、暴露時(shí)間長(zhǎng), 藥物在中國(guó)圓田螺體內(nèi)的殘留時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。

腎臟是生物的排毒器官，對(duì)藥物的排泄起重要的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中、高含量組處理下中國(guó)圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性先升后降再上升。初步認(rèn)為，由于天氣較熱，暴露環(huán)境中容易滋生細(xì)菌，對(duì)中國(guó)圓田螺的生長(zhǎng)有很大的負(fù)面影響，諾氟沙星的殺菌作用有利于試驗(yàn)組螺的存活，因此在暴露前期對(duì)照組酶活性低于這兩組的酶活。在試驗(yàn)后期高含量組螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性低于空白組，說(shuō)明藥物積累對(duì)中國(guó)圓田螺肝臟氨基比林-N-脫甲基酶的活性的負(fù)面影響，甚至比細(xì)菌的危害還要大。

在諾氟沙星的作用下，胃組織氨基比林-N-脫甲基酶的活性呈現(xiàn)出不規(guī)律的波動(dòng)趨勢(shì)，總的趨勢(shì)還是先誘導(dǎo)后抑制，其原因可能是胃食物中的諾氟沙星對(duì)胃壁產(chǎn)生了影響，由于個(gè)體差異，每一只中國(guó)圓田螺的胃中的食物不可能完全一致，因此產(chǎn)生波動(dòng)的趨勢(shì)，說(shuō)明胃組織不適合作為藥物殘留或者酶活測(cè)定的指標(biāo)。

在諾氟沙星的作用下，卵巢的氨基比林-N-脫甲基酶活性全都表現(xiàn)出抑制的效應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)期為中國(guó)圓田螺的繁殖期，這個(gè)時(shí)期卵巢非常敏感，因此盡管在低含量作用前期，其氨基比林-N-脫甲基酶活性也是被抑制的狀態(tài)。

在諾氟沙星作用下，肌肉中氨基比林-N-脫甲基酶活性的變化趨勢(shì)與卵巢一樣，其原因可能是中國(guó)圓田螺的足直接與沉積物中的藥物接觸，諾氟沙星直接并快速對(duì)肌肉起作用，快速在肌肉中蓄積。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，處理前期，各含量諾氟沙星對(duì)肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性有誘導(dǎo)作用，隨含量升高，藥物的誘導(dǎo)作用持續(xù)時(shí)間變短，誘導(dǎo)力度減小，后期則呈現(xiàn)抑制作用。在腎臟和胃組織中，低含量諾氟沙星對(duì)氨基比林-N-脫甲基酶活性先誘導(dǎo)后抑制，而中高含量對(duì)氨基比林-N-脫甲基酶為抑制作用。各含量諾氟沙星對(duì)敏感卵巢或直接接觸的肌肉氨基比林-N-脫甲基酶有抑制作用，含量越高抑制程度越大，但對(duì)中國(guó)圓田螺無(wú)明顯的致死效應(yīng)。低含量的諾氟沙星對(duì)中國(guó)圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性有顯著誘導(dǎo)作用，可以有效降解其他毒性物質(zhì)，含量較高時(shí)不僅不能促進(jìn)解毒作用，甚至可能會(huì)因?yàn)橐种瓢被攘?N-脫甲基酶活性而使其對(duì)其他藥物的抗性降低，并沿著食物鏈進(jìn)入人的生產(chǎn)生活中。因此，必須重視諾氟沙星以及其他抗生素的污染，及時(shí)有效治理。

[1] 王瑞旋, 陳畢生. 喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究概況[J]. 南方水產(chǎn), 2007, 3(3):73-79.

[2] 王宏偉，賴照，張潔，等. 水體沉積物中環(huán)境雌激素對(duì)底棲動(dòng)物的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33(4)：443-448.

[3] 鹿金雁. 叔丁基對(duì)羥基茴香醚和諾氟沙星對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)[D]. 廣州：暨南大學(xué), 2007.

[4] 趙建亮, 方怡向, 應(yīng)光國(guó). 工業(yè)廢水毒性鑒定評(píng)價(jià)方法體系的建議及其應(yīng)用示例[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2011, 20(3):549-559.

[5] Li D, Yang Y L, Zhang S J, et al. Effects of mammalian CYP3A inducers on CYP3A-related enzyme activities in grass carp (Ctenopharyngodonidellus):possible implications for the establishment of a fish CYP3A induction model[J]. Comp Biochem Physiol C:Toxicol Pharmacol, 2008, 147(1):17-29.

[6] 冷欣夫, 邱星輝. 細(xì)胞色素 P450 酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2001.

[7] 陳大健, 王加才, 張萍, 等. 氟苯尼考對(duì)鯽魚CYP2E1活性影響的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2007, 37(3):269-273.

[8] 韓華, 李健, 李吉濤, 等. 喹諾酮類藥物對(duì)牙鲆肝藥物代謝酶活性的影響[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(11):48-54.

[9] 何秀婷, 程章, 聶湘平, 等. 諾氟沙星對(duì)阿部鯔鰕鯱Ⅰ相、Ⅱ相酶活性及CYP1A1和P-gp mRNA 表達(dá)影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(4):846-853.

[10] 張喆, 李健, 陳萍, 等. 諾氟沙星對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦鰓和血清ECOD、氨基比林-N-脫甲基酶和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2012, 19(3):514-520.

EffectsofNorfloxacinonActivityofEnzymeAminopyrineN-Demethylase(APND)inSnailCipangopaludinachinensis

WANG Hongwei1, YANG Likun1, ZHAO Wenbo1, LI Linfeng1，XING Qingchao1，XIE Henghui2

( 1. College of Life Sciences,Hebei University, Baoding 071002, China；2. Middle School No. 1 at Yang Village, Wuqing District, Tianjin Municipality，Tianjin 300000，China )

The effects of norfloxacin blended in sediments on activity of aminopyrine N-demethylase(APND) were studied in different tissues of snailCipangopaludinachinensisin simulation. The results showed that different concentrations of sedimentary norfloxacin had different influence on the activity of the enzyme. For example，there were increase tendency in activities of enzyme in liver, kidney and stomach at the beginning of the experiment at low concentrations，and then decrease tendency, while the activities of enzyme in kidney and stomach were inhibited at middle and high concentrations of sedimentary norfloxacin. The activities of enzyme were shown to be declined in muscle and ovary.

Cipangopaludinachinensis；norfloxacin；aminopyrine-N-demethylase (APND)

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.020

S966.281

A

1003-1111(2017)04-0519-05

2016-07-08；

2016-09-12.

國(guó)家自然科學(xué)基金聯(lián)合資助項(xiàng)目(U1133005)；教育部留學(xué)回國(guó)基金資助項(xiàng)目(2014-2016)；河北省高層次人才項(xiàng)目(C2015003034)； 河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(D2013201105)；河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行補(bǔ)助費(fèi)資助項(xiàng)目(14967611D)；河北省生物學(xué)強(qiáng)勢(shì)特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2016)；生物學(xué)河北省國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科培育項(xiàng)目(2016)；河北大學(xué)中西部高校提升綜合實(shí)力工程項(xiàng)目(2016)；河北大學(xué)2016年國(guó)家級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610075014)；河北大學(xué)2016年研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(X2016072)；河北大學(xué)2016年校級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2016084); 河北大學(xué)2016年實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目(sy201662).

王宏偉(1970—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，博士；研究方向：水生生物學(xué). E-mail：13722283189@126.com.