鄭征帆，呂艷杰，王 佩，寧黔冀

( 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

日本沼蝦表皮蛋白-5基因全長(zhǎng)cDNA克隆及表達(dá)分析

鄭征帆，呂艷杰，王 佩，寧黔冀

( 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

為探究甲殼動(dòng)物表皮蛋白多樣性及其功能，根據(jù)表皮轉(zhuǎn)錄組資料，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到日本沼蝦表皮蛋白-5基因的cDNA全長(zhǎng)序列，分析其生物信息學(xué)、不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)特征以及KK-42對(duì)其表達(dá)特征的影響。日本沼蝦表皮蛋白-5基因的cDNA全長(zhǎng)796 bp，開(kāi)放閱讀框477 bp，編碼158個(gè)氨基酸，含RR基序，預(yù)測(cè)蛋白等電點(diǎn)為4.22，分子量為16.46 ku；氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)日本沼蝦表皮蛋白-5與克氏原螯蝦Casp-2相似性最高，為76%，與其他甲殼動(dòng)物表皮蛋白相似性為41%～53%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，日本沼蝦表皮蛋白-5基因在3個(gè)時(shí)期——蛻皮間期、蛻皮前早期和蛻皮前晚期均有表達(dá)，其中在脫皮前晚期的相對(duì)表達(dá)量最高，為蛻皮間期的1400倍，與之有極顯著差異(P<0.01)。KK-42處理顯著上調(diào)日本沼蝦表皮蛋白-5基因在蛻皮前早期的表達(dá)，在處理后3、6 h和48 h表達(dá)量分別是對(duì)照組的6.3、4.8和11.4倍。KK-42誘導(dǎo)日本沼蝦表皮蛋白-5基因的表達(dá)，使峰值前移，這可能是KK-42縮短日本沼蝦幼蝦蛻皮周期的機(jī)制之一。

日本沼蝦；表皮蛋白；基因克隆；表達(dá)；KK-42

由于堅(jiān)硬表皮的限制，甲殼動(dòng)物必須經(jīng)過(guò)蛻皮才能生長(zhǎng)，蛻皮是一個(gè)周期性的動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括舊表皮降解和新表皮的形成。作為表皮組成成分的幾丁質(zhì)是和蛋白質(zhì)以結(jié)合的形式存在，此蛋白即為表皮蛋白(CPs)，是甲殼動(dòng)物表皮中重要的結(jié)構(gòu)性蛋白，由蛻皮激素的靶組織——表皮上皮細(xì)胞按照一定的周期和步驟表達(dá)合成[1-2]。

表皮蛋白的表達(dá)與蛻皮周期的關(guān)系是研究此類蛋白功能的重要方面。采用分離純化方法獲得表皮蛋白，根據(jù)氨基酸測(cè)序結(jié)果推定堿基序列，在轉(zhuǎn)錄水平分析相關(guān)基因表達(dá)在蛻皮周期中的變化趨勢(shì)[3-5]。近年來(lái)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)大大加快了新表皮蛋白基因發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程，在日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)[6-7]、藍(lán)蟹(Callinectessapidus)[8]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[9-11]少數(shù)幾個(gè)物種獲得9個(gè)甲殼動(dòng)物表皮蛋白基因全長(zhǎng)。尚未見(jiàn)到日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)表皮蛋白的相關(guān)報(bào)道。

前期研究發(fā)現(xiàn)咪唑類物質(zhì)KK-42能縮短日本沼蝦幼蝦蛻皮周期[12]，機(jī)制尚不明確，推測(cè)與表皮蛋白表達(dá)有關(guān)。本試驗(yàn)采用cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)首次從日本沼蝦尾扇中克隆出一個(gè)表皮蛋白基因全長(zhǎng)，命名為日本沼蝦表皮蛋白-5(MnCP-5，GenBank 登錄號(hào)：KU356774)，對(duì)其進(jìn)行序列分析、不同蛻皮時(shí)期表達(dá)分析以及KK-42處理等相關(guān)研究，探究甲殼動(dòng)物表皮蛋白的多樣性，也為闡明KK-42縮短蛻皮周期的作用機(jī)制積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及KK-42處理

日本沼蝦幼蝦捕撈于河南衛(wèi)輝市順城關(guān)公園，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)后選取400尾體長(zhǎng)(3.0±0.5) cm，體質(zhì)量約0.30 g個(gè)體分為2組：KK-42試驗(yàn)組和對(duì)照組，其蛻皮周期的鑒定依據(jù)Cesar等[13]顯微形態(tài)學(xué)觀察的方法。試驗(yàn)組用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液浸泡處理1 min，取出后迅速去除水分，立刻置于水族箱中，室溫全天通氧飼養(yǎng)；對(duì)照組用不含KK-42溶液做相同的處理[14]。

1.2 日本沼蝦表皮蛋白-5基因全長(zhǎng)克隆

用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa) 試劑盒提取尾扇總RNA，微量紫外分光光度儀檢測(cè)RNA含量，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。按照SMARTerTMRACE 5′/3′Kit (Clontech) 試劑盒說(shuō)明, 合成cDNA第一鏈，用于全長(zhǎng)cDNA 5′和3′端序列快速擴(kuò)增的模板。根據(jù)表皮轉(zhuǎn)錄組資料及甲殼動(dòng)物表皮蛋白R(shí)R保守序列，設(shè)計(jì)降落PCR特異性引物RMnCP-5-R和RMnCP-5-F(表1)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用BIOMIGA Gel/PCR Extraction Kit回收，采用pUC19, Linearized(Clontech)連接，利用DH5α(TaKaRa)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)得到的陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)菌液PCR驗(yàn)證后由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)序。

表1 基因克隆和實(shí)時(shí)定量所用引物

1.3 日本沼蝦表皮蛋白-5基因序列特征分析

將5′-RACE片段和3′-RACE片段序列進(jìn)行拼接，開(kāi)放閱讀框利用ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查詢；Conserved Domain Search Service (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線工具進(jìn)行保守域分析；Protparam程序(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)氨基酸等電點(diǎn)、分子量等參數(shù)；TMHMM、SingalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/、http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)等在線軟件分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)信號(hào)肽。MEGA 6.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。SMS工具包(http://www.bio-soft.net/sms/)進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)。

1.4 日本沼蝦表皮蛋白-5基因的表達(dá)分析

MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa)試劑盒提取蛻皮間期、蛻皮前早期和蛻皮前晚期以及KK-42處理后0、3、6、12、24 h和48 h日本沼蝦步足RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)表皮轉(zhuǎn)錄組資料設(shè)計(jì)特異性引物QMnCP-5-F和QMnCP-5-R (表1)，18S rRNA 基因作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 每個(gè)樣本做3個(gè)平行。數(shù)據(jù)處理采用相對(duì)值2-△△CT計(jì)算，SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 日本沼蝦表皮蛋白-5基因cDNA全長(zhǎng)克隆

日本沼蝦表皮蛋白-5基因cDNA全長(zhǎng)796 bp，ORF包含158個(gè)氨基酸殘基，基因第1～136 bp為5′UTR區(qū)，第137～151位編碼以起始密碼子ATG為開(kāi)端的信號(hào)肽序列，覆蓋15個(gè)氨基酸殘基，幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域——RR基序從第90位氨基酸開(kāi)始至第124位氨基酸結(jié)束，覆蓋35個(gè)氨基酸殘基，終止密碼子TAG，3′UTR區(qū)有表明序列完整性的加尾信號(hào)AATAAA及polyA尾(圖1)。預(yù)測(cè)該蛋白等電點(diǎn)為4.22，分子量為16.46 ku，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 日本沼蝦表皮蛋白-5氨基酸序列同源性分析

利用MEGA 6.0軟件鄰接法將日本沼蝦表皮蛋白-5氨基酸與相關(guān)代表甲殼動(dòng)物和昆蟲(chóng)的表皮蛋白氨基酸序列共同構(gòu)建發(fā)育樹(shù)(圖2)，參與構(gòu)建發(fā)育樹(shù)的表皮蛋白均包含RR-1基序。結(jié)果顯示，日本沼蝦和其他甲殼動(dòng)物聚為1支，節(jié)肢動(dòng)物另聚3支，其中日本沼蝦表皮蛋白-5和克氏原螯蝦表皮蛋白Csap-2單獨(dú)聚為1小支，二者相距最近。經(jīng)BLASTP比對(duì)表明，日本沼蝦表皮蛋白-5氨基酸序列與紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)、美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)、黃道蟹(Cancerpagurus)、藍(lán)蟹、日本囊對(duì)蝦相似度41%～53%，其中與克氏原螯蝦Casp-2相似度最高，達(dá)76%(圖3)。

圖1 日本沼蝦表皮蛋白-5基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列實(shí)線方框：起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)；灰底框：poly(A)加尾信號(hào)(AATAAA)；*：終止密碼；下劃線：信號(hào)肽；虛線：RR基序；圓圈：RR基序中保守的氨基酸.

圖2 鄰接法構(gòu)建的日本沼蝦表皮蛋白-5與其他物種表皮蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 日本沼蝦表皮蛋白-5與其他物種表皮蛋白的氨基酸序列比對(duì)日本沼蝦CP-5：KU356774；藍(lán)蟹AMP6.0：AAV28477.1；藍(lán)蟹CP14.1：ABB91676.1；紅螯螯蝦M15：AIN36963.1；日本囊對(duì)蝦DD9A：BAA90875.1；克氏原螯蝦Casp-2：BAF73806.1；克氏原螯蝦SCBP-1：BAM99303.1；美洲螯龍蝦AMP1A：P81384.1；美洲螯龍蝦AMP4：P81388.1；黃道蟹AM1159：P81576.1.RR一致序列標(biāo)注于多序列下方.

2.3 蛻皮周期不同階段日本沼蝦表皮蛋白-5基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，日本沼蝦表皮蛋白-5基因在蛻皮間期、蛻皮前早期和蛻皮前晚期均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異(圖4)，在蛻皮前晚期急劇升高，是蛻皮間期的1400倍，與之呈極顯著差異(P<0.01)。

2.4 KK-42對(duì)日本沼蝦表皮蛋白-5基因表達(dá)的影響

KK-42處理能顯著上調(diào)基因的表達(dá)，尤其是蛻皮前早期和蛻皮間期。K-42處理后48 h，蛻皮間期的表達(dá)量是對(duì)照組的2.1倍(圖5a)；在3、6 h和48 h，蛻皮前早期表達(dá)極顯著升高，分別是對(duì)照組的6.3、4.8倍和11.4倍(圖5b)；在蛻皮前晚期，處理組的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(圖5c)。

3 討 論

RR基序[Gx8Gx6YxAxExGYx7Px2P](x代表任意氨基酸，阿拉伯?dāng)?shù)字代表任意氨基酸的數(shù)目)最先在昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，是表皮蛋白中分布最廣、研究最為深入的基序[15-18]。離體研究顯示，該基序能結(jié)合幾丁質(zhì)，覆蓋35個(gè)氨基酸殘基。甲殼動(dòng)物表皮蛋白是含RR基序、與蛻皮周期相關(guān)且種內(nèi)和種間相似度較低的一類結(jié)構(gòu)性蛋白。本試驗(yàn)首次克隆出日本沼蝦表皮蛋白-5基因cDNA全長(zhǎng)，含RR基序(圖1)。對(duì)甲殼動(dòng)物表皮蛋白的研究表明，RR基序可以鑒別表皮蛋白，是其特征性保守序列[1]。日本沼蝦表皮蛋白-5基因編碼蛋白預(yù)測(cè)分子量是16.46 ku，與克氏原螯蝦、藍(lán)蟹的全長(zhǎng)cDNA編碼蛋白類似[8-11]；蛋白呈酸性(等電點(diǎn)為4.22)，可能與表皮鈣化相關(guān)[9]。甲殼動(dòng)物表皮蛋白常含有12～19個(gè)aa不等的信號(hào)肽，日本沼蝦表皮蛋白-5含15個(gè)aa的信號(hào)肽，表明其屬于基質(zhì)蛋白，由上皮細(xì)胞分泌至胞外，參與表皮結(jié)構(gòu)的形成[9]。

圖4 日本沼蝦表皮蛋白-5 在不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)n=5/蛻皮時(shí)期.**表示與蛻皮間期比P<0.01.

圖5 KK-42處理后日本沼蝦表皮蛋白-5在不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)變化n=5/組/時(shí)間點(diǎn).a：蛻皮間期；b：蛻皮前早期；c：蛻皮前晚期.**表示與對(duì)照組比P<0.01.

在甲殼動(dòng)物周期性蛻皮過(guò)程中，表皮結(jié)構(gòu)也不斷地變化，蛻皮前新的上表皮和外表皮已經(jīng)形成，蛻皮后內(nèi)表皮逐漸形成[19]。日本沼蝦表皮蛋白-5基因在蛻皮前晚期顯著表達(dá)(圖4)，與克氏原螯蝦[10]、藍(lán)蟹[8,20]表皮蛋白的表達(dá)特征相一致，因此推測(cè)日本沼蝦表皮蛋白-5參與外表皮的形成。

前期研究顯示，KK-42能顯著提高日本沼蝦血淋巴中蛻皮激素20-羥蛻皮酮的滴度[21]，合成表皮蛋白的表皮上皮細(xì)胞是蛻皮激素的靶組織，推測(cè)KK-42 上調(diào)日本沼蝦表皮蛋白-5基因的表達(dá)是間接效應(yīng)；而蛻皮前晚期該基因表達(dá)顯著降低的原因，可能是KK-42促使蛻皮激素的峰值從蛻皮前晚期前移至蛻皮前早期，進(jìn)而加速了新表皮的形成，蛻皮周期縮短[12]。

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Full-lengthcDNACloningandExpressionofCuticularProtein-5inFreshwaterPrawnMacrobrachiumnipponense

ZHENG Zhengfan, Lü Yanjie, WANG Pei, NING Qianji

( College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China )

To explore the diversity and functions of cuticular proteins in crustacean, full-length cDNA of cuticular protein-5 in freshwater prawnMacrobrachiumnipponense(MnCP-5) was cloned using epidermis transcriptome by RACE technique. The bioinformatics, expression profile and effects of KK-42 for the expression of MnCP-5 were analyzed in different molt stages. The full sequence is 796bp containing a complete 477 bp ORF which encodes 158 amino acids with RR motif, a calculated molecular mass of 16.46 ku and pI of 4.22. Comparison of amino acid sequences in crustacean, MnCP-5 shared 41%-53% identity with others, and the maximal similarity of 76% with swamp red prawnProcambarusclarkiiCasp-2. The Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) showed that MnCP-5 was expressed on all 3 stages—C, D0-2and D3-4, while the relative expression level at stage D3-4was 1400 times as the level at stage C with very significant difference (P<0.01). KK-42 treatment can up-regulate the expression of MnCP-5 at stage D0-2, and the expression levels at 3, 6 and 48 h were 6.3, 4.8 and 11.4 times as the levels in control group. KK-42 can importantly move forward the peak expression of MnCP-5 from stage D3-4to D0-2, which is involved in one of the potential molecular mechanisms of KK-42 for shortening the molt cycle of juvenile freshwater prawn.

Macrobrachiumnipponense; cuticular protein; gene cloning; expression; KK-42

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.009

S917.4

A

1003-1111(2017)06-0747-06

2017-01-16；

2017-03-09.

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目(142300410021).

鄭征帆(1990—)，女，碩士研究生；研究方向：甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的體液調(diào)節(jié). E-mail: zhengzhengfan@163.com. 通訊作者：寧黔冀(1964—)，女，教授，博士；研究方向：甲殼動(dòng)物激素調(diào)控. E-mail: nqjnqj1964@163.com.