張 菡，戴 偉，石洪玥，陳成勛，王慶奎，邢克智

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)與養(yǎng)殖生態(tài)重點實驗室，天津 300384 )

遲鈍愛德華氏菌對雜交東方鲀rags基因表達(dá)的影響

張 菡，戴 偉，石洪玥，陳成勛，王慶奎，邢克智

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)與養(yǎng)殖生態(tài)重點實驗室，天津 300384 )

利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測冀研一號(菊黃東方鲀 ♀×紅鰭東方鲀♂)稚魚肝胰臟、脾臟、頭腎中重組激活基因rags在腹腔注射遲鈍愛德華氏菌后6、12、24、36、48、72 h內(nèi)相對表達(dá)量的變化情況。試驗結(jié)果顯示，感染遲鈍愛德華氏菌后，肝胰臟中rags基因表達(dá)呈下降趨勢，相對表達(dá)量峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h。脾臟和頭腎中rags基因表達(dá)均呈先升后降趨勢，但在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升。脾臟中，rags基因相對表達(dá)量峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h；頭腎中，rag1基因和rag2基因相對表達(dá)量峰值分別出現(xiàn)在攻毒后48 h和6 h。與對照組相比，腹腔注射遲鈍愛德華氏菌能引起冀研一號東方鲀rags基因表達(dá)上調(diào)，且rag1基因和rag2基因表達(dá)趨勢基本一致。

冀研一號東方鲀；重組激活基因；mRNA表達(dá)；遲鈍愛德華氏菌

冀研一號東方鲀是雌性菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)與雄性紅鰭東方鲀(T.rubripes)雜交子代。其幼魚尾鰭呈淺黃且略帶黑色，體表色斑花紋與菊黃東方鲀相近，形態(tài)特征與紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀存在明顯差異[1]。其食用口感與菊黃東方鲀相似，市場價值高于紅鰭東方鲀，但其生長速度快于菊黃東方鲀，接近于紅鰭東方鲀，存活率比親本高，一般約90%[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在抗逆性方面，冀研一號東方鲀對重金屬離子、水溫和鹽度波動具有較強的抗性[1，4-6]。Hansen等[7]首次克隆和分析虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的 rag1和 rag2。斑馬魚(Daniorerio)[8]、河鲀(Fugurubripes)[9]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[10]等rags基因研究也相繼被報道，國內(nèi)則針對斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[11]、赤點石斑魚(Epinephelusakaara)[12]、紅笛鯛(Lutjanussanguineus)[13]等進(jìn)行了研究。目前，rags在人和小鼠體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控已被深入研究報道，但未見有關(guān)冀研一號東方鲀的相關(guān)報道。本試驗對冀研一號東方鲀注射遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)，分析重組激活基因在攻毒不同時間點的表達(dá)量變化規(guī)律，旨在為東方鲀的免疫應(yīng)答提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

試驗用魚健康狀況良好、體表完整，體長(5.2±0.39) cm，由天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗分為對照組(注射磷酸緩沖鹽溶液pH 7.2，0.1 mol/L)和攻毒組(注射遲鈍愛德華氏菌，1×106cfu/mL)，每組3個平行，共120尾。對照組每尾魚腹腔注射50 μL無菌磷酸緩沖鹽溶液，而感染組注射等體積遲鈍愛德華氏菌菌液。將遲鈍愛德華氏菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃過夜培養(yǎng)，取200 μL培養(yǎng)液以涂布法在固體平板上培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)24 h，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液洗脫，計數(shù)，備用。注射開始前，采3尾普通試驗魚作為基礎(chǔ)組織樣本，注射6、12、24、36、48、72 h后取樣，每次每組取3尾，無菌條件下取出肝胰臟、脾臟和頭腎，分別置1.5 mL無RNA酶凍存管液氮保存，用于提取RNA。

1.2.2 總 RNA 提取及 cDNA第一條鏈合成

應(yīng)用Rnaiso Plus試劑(Takara工程大連有限公司)提取不同組織(肝胰臟、脾臟、頭腎)中的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，應(yīng)用分光光度計(德國Eppendorf)測量OD260nm/OD280nm值，將比值為1.7～2.1的RNA應(yīng)用PrimeScript RTase(Takara工程大連有限公司)合成cDNA第一條鏈。

1.2.3 rags 基因 mRNA 表達(dá)的定量分析

根據(jù)GenBank:EU871643.1和GenBank: AF108420.1中東方鲀β-actin、rag1、rag2基因保守序列設(shè)計引物(表1)，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR擴增體系為20 μL，包括6.4 μL ddH2O、0.8 μL正向引物、0.8 μL反向引物、2 μL模板和10 μL SYBRDE。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；3步法循環(huán)40次(95 ℃變性15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s)。基因結(jié)果采用相對表達(dá)量的形式，以2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

表 1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，對攻毒組和對照組rags基因相對表達(dá)量進(jìn)行T檢驗分析，對攻毒組內(nèi)各時間點rags基因相對表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

感染遲鈍愛德華氏菌后冀研一號東方鲀肝胰臟組織rags基因相對表達(dá)量變化見圖1。感染菌體后rags基因相對表達(dá)量逐漸下降，峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h；與對照組相比，攻毒后6、12、24 h rag1基因表達(dá)極顯著升高(P<0.01)；攻毒后24 h，rag2基因表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)，攻毒后 6、12 h時，rag2基因表達(dá)極顯著高于對照組(P<0.01)。

感染遲鈍愛德華氏菌后冀研一號東方鲀脾臟組織rags基因相對表達(dá)量變化見圖2。隨菌體感染時間延長，rags基因相對表達(dá)量呈先升后降趨勢，并在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升，其相對表達(dá)量峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h；在6 h時rag1基因相對表達(dá)量與其他各時間點的相對表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，第6、12、48 h時與對照組差異極顯著(P<0.01)；與對照組相比，感染菌體后rag2基因相對表達(dá)量在第6、12、24、48 h極顯著升高(P<0.01)。

感染遲鈍愛德華氏菌后冀研一號東方鲀頭腎組織rags基因相對表達(dá)量變化見圖3。菌體感染時間延長，rags基因相對表達(dá)量呈先升后降趨勢，并在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升；rag1基因相對表達(dá)量在攻毒后48 h達(dá)到最大值，顯著高于其他各時間點的相對表達(dá)量(P<0.05)，極顯著高于對照組(P<0.01)；rag2基因相對表達(dá)量在攻毒后6 h達(dá)到最大值，與其他各時間點的相對表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖1 肝胰臟組織不同時刻rag1和rag2基因相對表達(dá)量**表示攻毒組與對照組差異極顯著(P<0.01)；*表示攻毒組與對照組差異顯著(P<0.05).不同字母表示攻毒組內(nèi)不同時間點表達(dá)差異顯著.下同.

圖2 脾臟組織不同時刻rag1和 rag2基因相對表達(dá)量

圖3 頭腎組織不同時刻rag1和rag2基因相對表達(dá)量

3 討 論

3.1 rags基因在魚體不同組織中的表達(dá)

李幸等[14]以實時熒光定量方法檢測rag1基因在太平洋鱈(Gadusmacrocephalus)胸腺、頭腎、脾臟和肝臟的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)rag1基因僅在胸腺和頭腎兩種組織中表達(dá)。Mao等[12]采用同樣方法檢測rag1基因在赤點石斑魚的肝、頭腎、脾、胸腺、腦、肌肉、腸、心臟、鰓和性腺中表達(dá)情況，rag1基因轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在胸腺和頭腎組織中。但紅笛鯛經(jīng)滅活溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)免疫后，rag1基因在頭腎、胸腺、脾臟、肝臟、腸和腦組織中均有表達(dá)[13]。本試驗發(fā)現(xiàn)，rags基因不僅可在頭腎中表達(dá)，同時還在脾臟和肝胰臟中檢測到其表達(dá)，與紅笛鯛報道的結(jié)果相一致。是因為免疫原刺激，導(dǎo)致rags基因在魚體不同組織中產(chǎn)生差異表達(dá)。

3.2 rag1基因和rag2基因表達(dá)的協(xié)同性

rag1 和 rag2基因是重組激活基因由于序列差異而區(qū)分的。結(jié)構(gòu)上，在鯉科和鲀科中rag1基因含有兩個內(nèi)含子，而斑點叉尾和虹鱒中rag1基因只有一個內(nèi)含子，其他物種中rag1和rag2基因一樣，不含內(nèi)含子。目前，已有研究提出rag1基因和rag2基因能夠同步表達(dá)，并且二者功能上存在協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)冀研一號東方鲀肝胰腺、脾臟和頭腎中rag1和rag2基因表達(dá)趨勢基本一致。在滅活菌感染紅笛鯛不同組織中rag1和rag2基因表達(dá)量的變化趨勢也基本保持一致[13]。而Kapitonov等[15]提出rag1和rag2基因編碼得到的蛋白是通過相同的轉(zhuǎn)座子完成的。

3.3 細(xì)菌攻毒對rags基因表達(dá)量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，冀研一號東方鲀注射遲鈍愛德華氏菌后，肝胰臟中rags基因表達(dá)呈下降趨勢，有可能是因為細(xì)菌感染后導(dǎo)致v(d)j重組發(fā)生錯誤[16-18]。頭腎中rags基因表達(dá)均呈先升后降的趨勢，但在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升。這與頭腎所含的淋巴細(xì)胞密切相關(guān)[19]。Zhang等[13]應(yīng)用實時熒光定量方法檢測滅活溶藻弧菌免疫后紅笛鯛不同時間點rags基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在0～24 h，肝胰臟、脾臟和頭腎中rag1和rag2 mRNA 的表達(dá)量均下調(diào)至最低值，24～96 h，均呈先升后降且趨于平緩的趨勢。紅笛鯛和冀研一號東方鲀二者對細(xì)菌攻毒后的表達(dá)存在差異，分析原因可能在于以下兩點，其一可能是因為試驗魚不同，其二可能是因活菌與滅活菌的差異導(dǎo)致，活菌對機體的免疫刺激更為強烈，時間持續(xù)更長[20]。

綜上所述，腹腔注射遲鈍愛德華氏菌能引起冀研一號東方鲀rags基因表達(dá)上調(diào)，且rag1基因和rag2基因表達(dá)趨勢基本一致。rags基因作為特異性免疫系統(tǒng)的重要成員，在冀研一號東方鲀特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

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EffectsofEdwardsiellatardaInjectiononmRNAExpressionsofRecombinationActivatingGenesragsinJiyan-1Fugu

ZHANG Han, DAI Wei, SHI Hongyue, CHEN Chengxun, WANG Qingkui, XING Kezhi

( Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, Fisheries College, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China )

In this study, Jiyan-1 fuguTakifuguflavidus♀×T.rubripes♂ juveniles were injected withEdwardsiellatardafor different times (6, 12, 24, 36, 48, and 72 h), and mRNA expressions of recombination activating genes rags in liver, spleen and kidney were investigated using quantitative real-time PCR technology. The results showed that mRNA expressions of rags in liver was decreased with time, and reached the peak values 6 h after injection. The mRNA expression of rags in spleen and kidney were increased first and then decreased with a rebound in 48 h. The peak values of rags mRNA expressions in spleen were observed 6 h after injection, and rag1 and rag2 mRNA expressions in kidney reached the peak values in 48 h and 6 h, respectively. As compared to the control group,E.tardainjection upregulated mRNA expressions ofrags, and both rag1 and rag2 mRNA expressions were changed in the same trend.

Jiyan-1 fugu; recombination activating gene; mRNA expression;Edwardsiellatarda

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.018

2016-05-03；

2016-06-12.

國家星火計劃重大項目(2013GA610002)；天津市創(chuàng)新團(tuán)隊基金資助項目(TD12-5018)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃重點項目(13JCZDJC29200)；天津市科技支撐計劃重大項目(12ZCDZNC05900).

張菡(1990—)，女，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動物增養(yǎng)殖學(xué). E-mail：13820487312@163.com.通訊作者：邢克智(1956—)，男，教授，研究方向：水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖. E-mail：kzxing6668@126.com.

S942.5

A

1003-1111(2017)02-0216-04