張志紅，王菊華，戴年華，張國華，黃江麗，黃 黃，圣 平，丁建南

( 江西省科學(xué)院 生物資源研究所，江西 南昌 330096 )

甲殼素發(fā)酵液養(yǎng)殖草魚、鰱魚幼魚試驗

張志紅，王菊華，戴年華，張國華，黃江麗，黃 黃，圣 平，丁建南

( 江西省科學(xué)院 生物資源研究所，江西 南昌 330096 )

為研究甲殼素發(fā)酵液對草魚和鰱魚幼魚養(yǎng)殖效果，用商品殼聚糖作參比，基礎(chǔ)飼料為對照組，分析甲殼素發(fā)酵液對魚體生長和水質(zhì)環(huán)境等影響。試驗結(jié)果表明，甲殼素發(fā)酵液處理組草魚和鰱魚幼魚質(zhì)量相對增長率比對照組高36.25%和122.47% (P<0.05)，草魚體內(nèi)脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶3種消化酶分別比對照組高144.39%、29.53%和29.75%，鰱魚體內(nèi)消化酶比對照組高48.06%以上(P<0.05)。與對照組比較，甲殼素發(fā)酵液顯著降低水中亞硝態(tài)氮(61.84%)、氨態(tài)氮(30.06%)、總磷含量(52.43%)，提高了草魚對嗜水氣單胞菌抗性。在試驗條件下，甲殼素發(fā)酵液對草魚和鰱魚幼魚起到一定的促生長作用，并能改善水質(zhì)環(huán)境，甲殼素發(fā)酵液具有作為微生態(tài)制劑開發(fā)應(yīng)用的潛力。

甲殼素發(fā)酵液；殼聚糖；消化酶；嗜水氣單胞菌

甲殼素大量存在于節(jié)肢動物如蝦、蟹和昆蟲外殼中，也存在于菌類、藻類和高等植物的細胞壁中，分布極其廣泛，是保健食品、醫(yī)用材料以及化妝品行業(yè)重要原料[1]。殼聚糖又稱為脫乙酰甲殼質(zhì)、可溶性甲殼素、甲殼胺等，是由甲殼素脫乙?；笊傻闹辨湺嗵?，具有良好的生理活性和生物相容性[2]。殼聚糖作為飼料添加劑在動物養(yǎng)殖上應(yīng)用，具有調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)代謝、促進生長、增強抗氧化能力和提高抗病及免疫能力等作用，可部分替代抗生素等化學(xué)藥物，對推動動物養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)、健康發(fā)展十分有益[3-4]。甲殼素通過化學(xué)方法制備殼聚糖，因能耗高、環(huán)境污染嚴重越來越受到限制[5]。利用微生物降解甲殼素生產(chǎn)殼聚糖，降解產(chǎn)物豐富，操作過程安全環(huán)保。本試驗選用商品殼聚糖和課題組研制的甲殼素微生物發(fā)酵液，研究其在草魚(Ctenopharyngodonidellus)和鰱魚 (Hypophthalmichthysmolitrix)養(yǎng)殖中的效果，比較兩種殼聚糖產(chǎn)品對淡水魚生長性能、抗病能力和水質(zhì)的影響，為提高漁業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)、開發(fā)新產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

魚苗：草魚和鰱魚幼魚購于江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，體質(zhì)量約50 g，體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊。

飼料：購于江西省南昌市鑫泰飼料有限公司，主要成份含量為粗蛋白≥28.0%，粗脂肪≥8.5%，總磷≥0.60%，粗纖維≤10.0%，粗灰分≤11.0%，水分≤13.0%。

病原菌：草魚病原菌為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，購于上海海洋大學(xué)。甲殼素發(fā)酵液：是由3種芽孢桿菌(Bacillus)和1種酵母菌(Saccharomycessp.)聯(lián)合降解膠質(zhì)甲殼素得到的發(fā)酵液。發(fā)酵液中甲殼素降解為不同鏈長度的殼聚糖(脫乙酰度≥65%)，4種微生物含量≥1.0×109個/mL，含有大量脫乙酰酶和幾丁質(zhì)酶。

商品殼聚糖：購于山東青島海良生物制品有限公司，脫乙酰度為99%。

1.2 試驗方法

1.2.1 養(yǎng)殖試驗

試驗于室外4 m2、深0.5 m的水泥池中進行，設(shè)投喂甲殼素發(fā)酵液處理組(按池水量0.02%投入，每7 d潑灑一次)、投喂殼聚糖處理組(在基礎(chǔ)飼料中添加0.1%)、對照組(基礎(chǔ)飼料)，每組放草魚40尾，鰱魚10尾，每組3個重復(fù)。按初始魚體質(zhì)量的3%投喂基礎(chǔ)飼料，每日上下午各1次。馴養(yǎng)至攝食正常后，開始正式試驗。養(yǎng)殖水源為地下水，試驗過程中，池水日充氣時間約10 h。養(yǎng)殖60 d后，全部幼魚稱量質(zhì)量。

1.2.2 草魚攻毒試驗

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每個處理選擇20尾草魚放入90 cm×75 cm×60 cm的室內(nèi)水族箱內(nèi)，溫度約25 ℃，進行攻毒試驗。菌種活化3次，經(jīng)預(yù)試驗確定攻毒密度為4×107個/mL，按每尾0.1 mL，腹腔注射嗜水氣單胞菌液。每日記錄攻毒之后草魚的累積死亡數(shù)。按下式計算各處理相對保護率[6]。

相對保護率/%=(1-處理死亡率/對照死亡率)×100%

1.2.3 水質(zhì)測定

室外養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，測定水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和總磷含量，氨氮測定采用納氏試劑分光光度法，總磷采用鉬酸銨分光光度法，亞硝態(tài)氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[7]。

1.2.4 幼魚體內(nèi)消化酶測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后取饑餓1 d的幼魚，用南京建成生物工程研究所試劑盒測定魚體內(nèi)淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性。從每個處理組中隨機取幼魚6尾，取出全腸和肝胰臟，將全腸和肝胰臟一起稱量質(zhì)量，置于勻漿器中，加入10倍體積的高純水勻漿，于冰箱中4 ℃靜置過夜。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液置于冰箱中4 ℃待用[8]。脂肪酶活性測定以37 ℃條件下每克組織蛋白在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為1 個酶活力單位(U)。蛋白酶活性測定以每毫克組織蛋白37 ℃每分鐘水解生成1 μg氨基酸作為1個酶活力單位(U)。淀粉酶活性采用碘—淀粉比色法，以組織中每毫克蛋白在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位(U)。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SAS V8軟件Duncan氏法進行多重比較，P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 甲殼素發(fā)酵液對幼魚生長和抗病能力的影響

幼魚飼養(yǎng)60 d后甲殼素發(fā)酵液和殼聚糖處理組草魚質(zhì)量相對增長率分別比對照組高36.25%和24.26%，鰱魚為122.47%和72.3%，說明甲殼素發(fā)酵液對草魚和鰱魚幼魚均有促進生長效果，與商品殼聚糖和對照組差異顯著(P<0.05)(表1)。

表1 不同處理對草魚和鰱魚生長的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標有不同小寫字母表示差異達到顯著性(P<0.05).

攻毒1 d后對照組草魚死亡率達90%，第10 d全部死亡，甲殼素發(fā)酵液和殼聚糖處理組草魚死亡率較低，相對保護率分別達到70%和65%。甲殼素發(fā)酵液有減輕病原菌侵害，提高草魚抗病能力、持續(xù)保護幼魚和降低死亡率效果(表2)。

表2 草魚幼魚感染嗜水氣單胞菌后死亡情況

2.2 甲殼素發(fā)酵液對草魚和鰱魚幼魚消化酶的影響

從3種消化酶測定結(jié)果看，甲殼素發(fā)酵液處理組的草魚體內(nèi)脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶均顯著高于對照組和殼聚糖組(P<0.05)，分別比對照組高144.39%、29.53%和29.75%，分別比殼聚糖處理組高13.76%、18.51%和6.23%(表3)。同樣，甲殼素發(fā)酵液處理組鰱魚體內(nèi)3種消化酶顯著高于對照組(P<0.05)，甲殼素發(fā)酵液明顯促進了草魚和鰱魚幼魚體內(nèi)消化酶活力。

表3 不同處理對草魚和鰱魚體內(nèi)消化酶影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標有不同小寫字母表示差異達到顯著性(P<0.05).

2.2 甲殼素發(fā)酵液對養(yǎng)殖水體的影響

與對照組比較，甲殼素發(fā)酵液處理組水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和總磷含量分別降低61.84%、30.06%和52.43%，差異顯著(P<0.05)；殼聚糖處理組分別比對照組降低1.08%、3.92%和2.22%(P>0.05)(表4)。甲殼素發(fā)酵液改善水質(zhì)效果好于殼聚糖處理組。

表4 不同處理對養(yǎng)殖水體參數(shù)的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 甲殼素發(fā)酵液對促進幼魚生長的影響

大量研究表明殼聚糖應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖，具有改善動物攝食性能、促進機體生長效果。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，草魚飼料中添加殼聚糖能顯著促進草魚生長。于東祥等[9]在對真鯛(Pagrosomusmajor)幼魚的試驗中比較殼聚糖與腐植酸鈉、海藻酸鈉等不同添加劑對幼魚生長影響，殼聚糖處理組比對照組體質(zhì)量增28.03%，效果好于其他添加劑。殼聚糖對水產(chǎn)動物促生長作用主要表現(xiàn)為提高消化酶活性，研究認為提高腸道消化酶活性是殼聚糖促進魚體生長的重要原因之一[10]。本試驗中，甲殼素發(fā)酵液和商品殼聚糖均能提高3種消化酶活性，進而提高草魚和鰱魚生長速度。甲殼素發(fā)酵液不僅含有殼聚糖、脫乙酰酶、幾丁質(zhì)酶等活性物質(zhì)，而且還有芽孢桿菌和酵母菌等有益微生物，促生長效果比殼聚糖處理組明顯。研究認為芽孢桿菌定殖在腸道后刺激腸道內(nèi)壁，增加內(nèi)源性消化酶的分泌，提高消化吸收能力，保證機體快速生長[11-12]。

3.2 甲殼素發(fā)酵液對提高幼魚抗病能力的影響

閆大偉等[6]研究表明殼聚糖可提高草魚抗病(嗜水氣單胞菌)能力，且隨著殼聚糖添加量的增加呈先升后降的趨勢。Anthi等[13]在飼料中添加殼聚糖連續(xù)飼喂鯪魚(Cirrhinamolitorella)30、60、90 d后注射嗜水氣單胞菌，結(jié)果表明殼聚糖處理的魚體明顯提高了抗病能力，隨著殼聚糖處理時間延長抗病能力增強。水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的芽孢桿菌可抑制副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和哈維弧菌(V.harveyi)等病原菌繁殖[14]，提高腸道中有益菌群乳酸桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)含量[15]，增強消化系統(tǒng)穩(wěn)定性和自身調(diào)節(jié)能力，改善腸道微生態(tài)環(huán)境。芽孢桿菌也能提高機體免疫相關(guān)酶如超氧化物歧化酶和酚氧化酶等活性[16]。本次試驗結(jié)果表明，甲殼素發(fā)酵液能明顯提高草魚幼魚抗嗜水氣單胞菌的能力，減輕病原菌侵害，保護幼魚、降低死亡率。

3.3 甲殼素發(fā)酵液對水質(zhì)的影響

水質(zhì)環(huán)境優(yōu)劣是水產(chǎn)動物養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵，在養(yǎng)殖過程中各種殘餌和排泄物影響水質(zhì)，引起水產(chǎn)動物死亡[17]。殼聚糖廣泛應(yīng)用在廢水處理中，可作為吸附劑、絮凝劑及抑菌劑等[18-19]。任秀芳等[20]在水體中添加羧化殼聚糖，能顯著降低水體中氨氮、硫化氫、亞硝態(tài)氮的含量，孫艷輝等[21]在體外模擬條件下，研究了殼聚糖對亞硝態(tài)氮的清除作用，隨殼聚糖用量增加對亞硝態(tài)氮清除能力也升高。芽孢桿菌對水質(zhì)改善也有一定效果，李永芹等[22]研究表明，芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝態(tài)氮的降解率分別為81.9%和64.3%，對凈化養(yǎng)殖池塘水質(zhì)有明顯作用。張峰峰等[23]研究認為芽孢桿菌可迅速有效的降低水體中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量，4 d去除率均達99%以上，可有效降低水體pH值。本試驗中甲殼素發(fā)酵液處理顯著降低水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和總磷含量，對養(yǎng)殖水體改善具有顯著效果。

致謝

感謝江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所章海鑫等同志對本研究給予的指導(dǎo)和幫助。

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EffectsofChitinFermentationLiquidonGrassCarpandSilverCarp

ZHANG Zhihong, WANG Juhua, DAI Nianhua, ZHANG Guohua, HUANG Jiangli, HUANG Huang, SHENG Ping, DING Jiannan

( Institute of Biological Resources, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330029, China )

chitin fermentation liquid (CFL); chitosan; digestive enzyme;Aeromonashydrophila

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.017

2016-01-18；

2016-06-21.

江西省科技支撐計劃項目(2011BBF60043).

張志紅(1972-)，女，副研究員，博士；研究方向：資源環(huán)境和微生物.E-mail：zzh04scau@126.com. 通訊作者：丁建南(1955-)，男，研究員，博士；研究方向：微生物生態(tài). E-mail：345810710@qq.com.

S942.3

A

1003-1111(2017)02-0212-04