辛 雪，楊 錚，楊慧娣

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010110）

高脂食物誘導(dǎo)的肥胖小鼠不同腦區(qū)即刻早期蛋白和酪氨酸羥化酶的變化*

辛 雪，楊 錚△，楊慧娣△

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010110）

目的：在高脂食物誘導(dǎo)肥胖的小鼠中檢測(cè)多巴胺神經(jīng)元的表達(dá)。方法：10只雄性小鼠飼喂高脂膳食作為高脂食物組（HFD），10只雄性小鼠飼喂10%脂肪膳食作為對(duì)照組（NCD）。實(shí)驗(yàn)第10周，小鼠禁食12 h后稱重，尾靜脈取血測(cè)定基礎(chǔ)血糖水平；實(shí)驗(yàn)11周進(jìn)行葡萄糖耐受（GTT）測(cè)試和胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)（ITT）；實(shí)驗(yàn)12周，動(dòng)物禁食4 h后處死，測(cè)定血清胰島素和瘦素（leptin）濃度，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)即刻早期蛋白（c-Fos-ir）和酪氨酸羥化酶（TH-ir）的表達(dá)。結(jié)果：飼喂12周高脂食物后，HFD組體重明顯增加。GTT測(cè)試顯示HFD組在15 min和30 min血糖濃度均明顯高于NCD組（p＜0.05）。ITT測(cè)試顯示HFD組在15 min和30 min血糖濃度均顯著高于NCD組（p＜0.05）。同時(shí)，禁食后，HFD組的胰島素濃度和leptin濃度顯著高于NCD組（p＜0.01）。免疫組化結(jié)果表明HFD組在伏隔核、下丘腦室旁核、腹側(cè)背蓋區(qū)和黑質(zhì)的c-Fos-ir細(xì)胞數(shù)均明顯多于NCD組（p＜0.01），且腹側(cè)被蓋區(qū)和黑質(zhì)的TH-ir和共表達(dá)TH／Fos-ir細(xì)胞也顯著多于NCD組（p＜0.01）。而且HFD組VTA區(qū)和SN區(qū)TH-ir的細(xì)胞數(shù)與HFD組小鼠的終體重呈正相關(guān)（p＜0.05）。結(jié)論：長(zhǎng)期飼喂高脂食物導(dǎo)致的肥胖與獎(jiǎng)賞系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)元的可塑性有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】高脂食物；肥胖；即刻早期蛋白；酪胺酸羥化酶

體重過高和肥胖已經(jīng)成為一個(gè)重要的醫(yī)療和公共健康問題。肥胖能增加心血管疾病、II型糖尿病和某些癌癥的發(fā)病率［1］。胰島素抵抗（insulin resistance）是某些代謝性疾病的一個(gè)共同特征，在肥胖和2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。它是指脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞對(duì)正常濃度胰島素反應(yīng)不足的現(xiàn)象，導(dǎo)致胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性的分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定［2］，而它的分子機(jī)制還不清楚。

由脂肪細(xì)胞分泌的瘦素（leptin）是一種厭食性的神經(jīng)肽，通過血腦屏障作用于下丘腦調(diào)節(jié)能量平衡和攝食行為［3］。下丘腦是調(diào)節(jié)攝食和能量平衡的重要中樞，從弓狀核 （arcuate nucleus，ARC）投射到下丘腦其它核如室旁核 （paraventricular nucleus，PVN），腹正中核 （ventromedial hypothalamus，VMH）的神經(jīng)環(huán)路對(duì)調(diào)節(jié)攝食和體重起到重要的作用［4，5］。攝入過多高能量的食物是導(dǎo)致肥胖的一個(gè)重要因素?？煽诘母咛呛透咧澄锪钊擞鋹偅苤厮芤恍┥窠?jīng)通路［5］。這些食物的攝入與大腦獎(jiǎng)賞環(huán)路有關(guān)。多巴胺神經(jīng)元起源于中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）和黑質(zhì) （substantia nigra，SN），它支配邊緣系統(tǒng)，包括伏隔核 （nucleus accumbens，NAcc）和背側(cè)紋狀體 （dorsal striatum），是組成動(dòng)機(jī)和獎(jiǎng)賞的神經(jīng)回路的一個(gè)重要部分［1，5］。多巴胺系統(tǒng)在自然和人為的獎(jiǎng)賞中，起著核心的作用。然而，引起肥胖的食物對(duì)多巴胺神經(jīng)的影響仍然不清楚［4］。c-Fos蛋白是研究各腦區(qū)功能性的神經(jīng)解剖學(xué)的一個(gè)非常有用的工具。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH），兒茶酚胺合成的限速酶，是多巴胺的一個(gè)標(biāo)記物［4，5］。本實(shí)驗(yàn)假設(shè)小鼠長(zhǎng)期暴露于高脂食物，探討肥胖與DA信號(hào)的改變之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

C57BL／6小鼠，雄性，10周大，體重 20 g，購(gòu)買于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)。單籠飼養(yǎng)，飼料為普通飼料，自由攝食飲水。每日更換飲水和飼料，保持動(dòng)物生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度為 （22±1）℃，光照時(shí)間為每日 8：00～20：00。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

20只C57BL／6小鼠單籠飼養(yǎng)1周，之后根據(jù)動(dòng)物體重隨機(jī)分成對(duì)照組和高脂組（n＝10），對(duì)照組飼喂10%脂肪食物（脂肪產(chǎn)能占能量的10%，下同），高脂組飼喂45%高脂食物，實(shí)驗(yàn)12周。每周測(cè)定1次攝食量和體重。實(shí)驗(yàn)第10周，小鼠禁食12 h后稱，尾靜脈取血測(cè)定基礎(chǔ)血糖水平；實(shí)驗(yàn)11周進(jìn)行葡萄糖耐受（glucose tolerance tests，GTT）測(cè)試和胰島素抵抗（insulin tolerance tests，ITT）實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn) 12周，動(dòng)物禁食4 h后處死，測(cè)定血清胰島素和leptin濃度，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)即刻早期蛋白c-Fos-ir和酪氨酸羥化酶（TH-ir，多巴胺轉(zhuǎn)化的限速酶）的表達(dá)。

1.3 主要試劑

10%和 45%脂肪食物（Research Diet Co.）；Ultrasensitive mouse insulin ELISA試劑盒（瑞士Mercodia公司，貨號(hào)10-1249-01）；Leptin ELISA試劑盒（美國(guó)Alpco公司，貨號(hào) 47-ADPMS-E01）；c-Fos抗體，1∶8 000（Santa Cruz Biotechnology）；羊抗兔 IgG，1∶300（Vector，Burlingame公司，貨號(hào)BA-1000）；抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物（Vector，Burlingame公司，貨號(hào) Vectastain Elite）；Tyrosine Hydroxylase，1∶8 000（Chemicon公司，貨號(hào) AB152）。

1.4 葡萄糖耐受測(cè)試

在第10周，小鼠禁食12 h后稱重，尾靜脈取血測(cè)定基礎(chǔ)血糖水平。腹腔注射50%葡萄糖2.0 mg／g后，分別在 15 min，30 min，60 min和 120 min后取血測(cè)定其血糖濃度。

1.5 胰島素耐受測(cè)試

葡萄糖耐受測(cè)試后，小鼠恢復(fù)1周，測(cè)定胰島素抵抗。小鼠禁食4 h，腹腔注射重組人胰島素（0.75 U／kg），取血測(cè)定0 min、10 min、30 min和60 min時(shí)血糖濃度。

1.6 血清胰島素和Leptin濃度的測(cè)定

動(dòng)物禁食4 h處死后，用ELISA試劑盒測(cè)定血清胰島素和Leptin濃度。Ultrasensitive mouse insulin ELISA試劑盒，測(cè)定胰島素濃度。Leptin ELISA試劑盒，測(cè)定leptin的濃度。詳細(xì)的操作步驟參照ELISA試劑盒中的說明書進(jìn)行。

1.7 免疫組織化學(xué)測(cè)定多巴胺神經(jīng)元（DA）的表達(dá)

每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 （n＝5）以10 g／L戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg／kg），經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈勻速灌注37℃生理鹽水和4%多聚甲醛的磷酸緩沖液 （pH 7.2，0.1 mol／L）。將腦移入多聚甲醛中固定 4 h。移入含30%蔗糖的磷酸緩沖液中，4℃過夜。-20℃冰凍連續(xù)切片（冠狀切片），片厚20μm。間隔80μm的切片用以前已經(jīng)建立的方法做c-Fos和TH的免疫組化［1］。簡(jiǎn)短地說，切片在1%硼氫化鈉中孵育20 min。10%山羊血清1 h。切片在兔抗c-Fos抗體，4℃孵育24 h。之后，切片在生物素化的羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物室溫90 min，DAB（加入鎳粉）顯色。之后，切片在兔抗-TH室溫過夜，切片在生物素化的羊抗兔IgG室溫孵育2 h，抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物，室溫90 min，DAB顯色。

每只小鼠各取3張不同斷面切片。并用Image J分析軟件在各腦區(qū)隨意選取三個(gè)視野，測(cè)量DA陽(yáng)性神經(jīng)元胞體個(gè)數(shù)（反映DA相對(duì)含量）。計(jì)算每組切片單位面積內(nèi)DA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目（平均密度）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤（ˉx±SE）表示，采用SPSS17.0軟件 （SPSSInc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在統(tǒng)計(jì)分析前，所有數(shù)據(jù)用 Kolmogorov-Smirnov和Levene分別進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。體重和攝食量采用重復(fù)測(cè)量，進(jìn)一步的差異用 t-test檢測(cè)。胰島素、c-Fos-ir、TH-ir和 TH／c-Fos細(xì)胞的組間差異采用 t-test。

2 結(jié)果

2.1 體重和攝食量的改變

與飼喂10%脂肪食物的NCD組相比，飼喂45%高脂食物后，HFD組的體重從第6周開始顯著增加（p＜0.05，p＜0.01，表 1），而攝食量沒有變化（表2）。

Tab.1 Body weight in C57BL／6 during 12 weeks（g，ˉx±ˉsx，n＝10）

Tab.2 Food intake in C57BL／6 during 12 weeks（g，ˉx±sˉx，n＝10）

2.2 葡萄糖耐受測(cè)試和胰島素耐受的變化

GTT測(cè)試顯示15 min和30 min HFD組的血液中葡萄糖的濃度高于對(duì)照組（圖 1a，p＜0.05）。HFD組的血糖曲線下的面積AUG值高于NCD組（t＝1.865，p＜0.05，圖 1b）。表明 HFD組胰島素調(diào)節(jié)血糖的能力下降。GTT測(cè)試期間，血糖的濃度受胰島素敏感性和胰島素濃度的影響。為了檢測(cè)是胰島素敏感性降低還是葡萄糖刺激的胰島素反應(yīng)降低了。因此，又做了ITT測(cè)試。ITT測(cè)試發(fā)現(xiàn)，血糖的濃度在15 min和30 min HFD組小鼠血糖濃度明顯高于 NCD組（p＜0.05，p＜0.01，圖 2a），且 HFD組的血糖曲線下的面積AUG值也顯著高于NCD組（p＜0.01，圖 2b）。

Fig.1 Glucose tolerance tests（GTT）（ˉx±sˉx，n＝10）a：Blood glucose；b：Area-under-concentration curve（AUC）value of glucose in GTT NCD：Control group；HFD：High fat diet group*p＜0.05 vs NCD group

Fig.2 Insulin tolerance tests（ITT）（ˉx±sˉx，n＝10）a：Blood glucose；b：Area-under-concentration curve（AUC）value of glucose in ITT NCD：Control group；HFD：High fat diet group*p＜0.05 vs NCD group

2.3 胰島素和Leptin的濃度的改變

HFD組的胰島素濃度比NCD組高出4倍（p＜0.05，圖3a），提示發(fā)生胰島素抵抗。同時(shí)，HFD組的leptin濃度比 NCD組高出 2.5倍（p＜0.05，圖3b）。

Fig.3 Plasma insulin（a）and leptin concentration（b）（ˉx±sˉx，n＝5）NCD：Control group；HFD：High fat diet group*p＜0.05 vs NCD group

2.4 c-Fos-ir和DA神經(jīng)元在腦中的表達(dá)

飼喂高脂食物12周后，HFD組c-Fos-ir細(xì)胞表達(dá)在下丘腦和中腦系統(tǒng)的某些區(qū)有差異表達(dá)；TH-ir陽(yáng)性細(xì)胞在下丘腦PVN區(qū)和ARC區(qū)及中腦VTA區(qū)和SN區(qū)表達(dá)差異顯著。具體地說，HFD組的c-Fosir陽(yáng)性細(xì)胞在NAcc區(qū)（表3，圖4a），下丘腦 PVN區(qū)（表 3，圖 4b）和中腦 VTA區(qū)、SN區(qū)（表 3，圖 4c）與NCD組相比顯著增加（p＜0.01）。下丘腦LH、VMH和ARC區(qū)，HFD組和NCD組的c-Fos-ir陽(yáng)性細(xì)胞沒有任何差異。HFD組TH-ir陽(yáng)性細(xì)胞在PVN區(qū)（表3，圖 4b），VTA區(qū)（表 3，圖 4c）和 SN區(qū)（表 3，圖 4c）明顯比NCD組增高（p＜0.05）。且VTA區(qū)和SN區(qū)TH-ir陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與HFD組小鼠的終體重呈正相關(guān)（p＜0.05，圖 5a、5b）。但是，在 ARC區(qū) NCD組和HFD組的TH-ir陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒有任何差異。HFD組c-Fos-ir／TH-ir共表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞在 PVN區(qū)（表 3，圖4b），中腦 VTA區(qū)（表 3，圖 4c）和 SN區(qū)（表 3，圖 4c）顯著高于NCD組（p＜0.05），但是在ARC區(qū)沒有任何變化。

Tab.3 Group differences in c-Fos-ir，TH-ir，and TH-ir／c-Fos-ir labeling in the brain of male mice that were fed normal food（NCD）or high fat food（HFD）（ˉx±sˉx，n＝5）

Fig.4 Photomicrographs displaying cells labeled for Fos-ir（blackunctuate nuclear staining）or TH in the NAcc（a）or PVN（b），VTA（c）and SN（c）（Scale bar＝100μm）aca：Anterior commissure；NAcc：Nucleus accumbens；3v：3rd ventricle；PVN：Paraventricular nucleus of the hypothalamus；VTA：Ventral tegmental；mm：Medial mammillary nucleus medial part；SN：Substantia nigra

Fig.5 Significant correlations were found between the final body weight and the levels of TH-ir positive cells in the ventral tegmental area（VTA，a）and substantia nigra（SN，b）of high HFD mice（n＝5）

3 討論

本研究結(jié)果表明小鼠飼喂12周45%高脂食物后，體重明顯增加。GTT測(cè)試表明胰島素調(diào)節(jié)血糖的能力下降；ITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HFD組胰島素敏感性降低；同時(shí)禁食后HFD組胰島素的濃度高于NCD組；這些結(jié)果都證明HFD組發(fā)生了胰島素抵抗。此外，VTA區(qū)和SN區(qū)的TH-ir的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和TH／c-Fos共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于NCD組。VTA區(qū)和SN區(qū)的TH-ir的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與HFD組小鼠的終體重呈正相關(guān)關(guān)系，暗示中腦多巴胺神經(jīng)元增多參與HFD組體重調(diào)節(jié)。HFD組前腦NAcc的活性顯著增加。這些結(jié)果暗示中腦獎(jiǎng)賞系統(tǒng)可能參與體重增加的調(diào)節(jié)。

小鼠飼喂12周45%高脂食物后，與對(duì)照組（NCD組）相比增加10 g，但是攝食量沒有變化。由于GTT期間，葡萄糖的濃度受胰島素敏感性和胰島素濃度的影響；所以測(cè)試ITT用來檢測(cè)是外周組織的胰島素敏感性降低，還是血糖刺激胰島素的反應(yīng)減少。ITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示胰島素的敏感性降低，而相似的結(jié)果在 fat-1小鼠中也被發(fā)現(xiàn)［6］。HFD組胰島素降低血糖的能力受到影響，發(fā)生了胰島素抵抗。這與大鼠的研究結(jié)果一致［7］。這些結(jié)果表明食物中脂肪含量的增多會(huì)損傷小鼠的葡萄糖耐受和胰島素敏感，從而使血糖增多，誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生。

能量平衡的調(diào)節(jié)依賴于腦對(duì)饑餓和飽腹時(shí)循環(huán)因子變化的適應(yīng)能力。下丘腦是控制能量平衡的重要結(jié)構(gòu)［4］。脂肪細(xì)胞分泌leptin的濃度HFD組高出NCD組2.5倍。這些結(jié)果表明HFD組的能量高于NCD組。一個(gè)經(jīng)典的基底神經(jīng)節(jié)的獎(jiǎng)賞系統(tǒng)包括從VTA區(qū)投射到腹側(cè)紋狀體即NAcc核的多巴胺神經(jīng)元［3］。VTA-NAcc通路對(duì)獎(jiǎng)賞和藥物濫用的鞏固特別重要［3，8，9］。NAcc是調(diào)節(jié)獎(jiǎng)賞行為的一個(gè)重要的前腦結(jié)構(gòu)［3］。應(yīng)用c-fos描繪與攝食反應(yīng)有關(guān)的腦區(qū)和調(diào)節(jié)獎(jiǎng)賞行為的核團(tuán)時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有HFD組下丘腦PVN核c-Fos-ir陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加，而下丘腦的其他核團(tuán)如LH、VMH和ARC區(qū)沒有變化，表明PVN區(qū)是下丘腦調(diào)節(jié)能量平衡的一個(gè)重要區(qū)。同時(shí)，HFD組 TH-ir陽(yáng)性細(xì)胞及 TH-ir／c-Fos共表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞在HFD組的VTA和SN區(qū)顯著增加，表明攝入高脂食物會(huì)激活中腦獎(jiǎng)賞系統(tǒng)，從而增加攝食的欣快感，這解釋了為什么兩組攝食量沒有差異。本結(jié)果與小鼠飼喂40%高脂食物的結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)飼喂40%高脂食物20周后，多巴胺受體在 NAcc、VTA區(qū)和SN區(qū)D2、D4和TH mRNA的表達(dá)增加［10］。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)通過VTA區(qū) leptin受體，leptin劑量依賴性的調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFD組的leptin濃度增加，同時(shí)VTA的多巴胺神經(jīng)元表達(dá)增多，這些結(jié)果提示leptin可能調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)元的調(diào)節(jié)，但是需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。高脂食物誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)的可塑性增加肥胖和胰島素抵抗，但是具體機(jī)制還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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Immediate-early c-fos and tyrosine hydroxylase protein expression in different brain regions in high-fat induced obesity in mice

XIN Xue，YANG Zheng△，YANG Hui-di△
（Basic Medical School of Inner Mongolia Medical University，Huhehaote 010110，China）

Objective：To examine brain dopamine expression in chronic high-fat diet（HFD）-induced obese mice.Methods：Ten male mice were fed by a high-fat diet（HF：45%of calories from fat）for 12 weeks and then classified as HFD group.Ten male mice were fed a low-fat diet（LF：10%of calories from fat）and used as control group（NCD）.In the 10thweek，the blood of the caudal vein was collected to determine the basal blood glucose level after both groups mice were fast for 12 h.Intraperitoneal（IP）glucose tolerance test（GTT）and insulin tolerance（ITT）were performed in HFD and NCD mice in the 12thweek.Animals were sacrificed after fasting for 4 hours at the 12thweek.Brain tissues were processed for Fos-ir and TH-ir by immunohistochemistry.Results：After 12 weeks of feeding，body weight was significant higher in HFD mice than that in NCD ones.During GTT and ITT，HFD mice had significantly decreased glucose tolerance and insulin tolerance at 15 min and 30 min respectively than NCD ones（p＜0.05）.There were higher plasma insulin concentration and leptin concentration in HFD mice than those in NCD ones（p＜0.05）.High fat-induced increased body weight was associated with increased cellular activation，indicated by Fos immunoreactive（ir）staining，in nucleus accumbens（NAcc），paraventricular nucleus（PVN），ventral tegmental area（VTA）and substantia nigra（SN）than those of NCDones（p＜0.05）；and also significantly associated with enhanced in the number of cells labeled for tyrosine hydroxylase（TH-ir），and the number of cells co-labeled for TH-ir／Fos-ir in the VTA and SN than those of NCD ones（p＜0.01）.Moreover，there was significantly relationship TH-ir positive cell numbers with final body weight in VTA and SN in HFD mice（p＜0.05）.Conclusion：The results showed that chronic consumption of high-fat food was associated with plasticity-related changes in reward circuitry in mice.

high fat diet； obesity； immediate-early c-fos； tyrosine hydroxylase

R73-3

A

1000-6834（2017）06-572-05

10.12047／j.cjap.5484.2017.135

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016MS0367）

2016-08-08

2017-06-23

△【通訊作者】Tel：0471-6657570；E-mail：yanghuidi1980＠163.com，670598470＠qq.com