李月靈 王高峰 彭 紅 李慧川

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院,鄭州 450063)

五味子乙素抑制胃癌SNU-1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究①

李月靈 王高峰 彭 紅 李慧川②

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院,鄭州 450063)

目的觀察五味子乙素對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，探討其誘導(dǎo)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法不同濃度五味子乙素組和順鉑組加入到SNU-1細(xì)胞中，作用24 h后，MTT法測(cè)定藥物組對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的五味子乙素誘導(dǎo)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡率，Transwell法檢測(cè)五味子乙素對(duì)SNU-1細(xì)胞侵襲的抑制作用，采用間接熒光標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的變化；Western blot法檢測(cè)胃癌SNU-1細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和MMP-9的表達(dá)。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，10、50和100 μg/ml的五味子乙素和順鉑對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用明顯，10、50和100 μg/ml的五味子乙素作用胃癌SNU-1細(xì)胞后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著下降，10、50和100 μg/ml的五味子乙素作用胃癌SNU-1細(xì)胞48 h后均能誘導(dǎo)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡；ROS水平隨著五味子乙素的濃度增加而增加明顯；10、50和100 μg/ml的五味子乙素上調(diào)Caspase-3、Bax、E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、N-cadherin和MMP-9的表達(dá)。結(jié)論五味子乙素可能是通過(guò)Caspase-3級(jí)聯(lián)凋亡途徑、線粒體途徑和ROS水平提高來(lái)誘導(dǎo)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡，也可能通過(guò)破壞細(xì)胞間和基底膜黏附性及增加腫瘤細(xì)胞間的穩(wěn)定性，來(lái)抑制胃癌SNU-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

五味子乙素；胃癌SNU-1細(xì)胞；增殖抑制作用；活性氧(ROS)水平；Caspase-3；MMP-9

胃癌是胃上皮組織發(fā)生的惡性腫瘤[1,2]，現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)顯示，胃癌發(fā)生率僅次于肺癌、乳腺癌和腸癌，排名第4位，隨著環(huán)境的惡劣，胃癌的發(fā)生率正在不斷的增加，胃癌嚴(yán)重危脅人類的生命健康[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌發(fā)病信號(hào)比較隱蔽，在發(fā)病早期常無(wú)癥狀和體征的變化，容易出現(xiàn)漏診的情況，在發(fā)現(xiàn)時(shí)常常到了癌癥的晚期[5]。目前，胃癌的主要治療手段是以手術(shù)治療為主，近年來(lái)天然活性物質(zhì)治療腫瘤逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6,7]。

中藥配合放、化療在治療腫瘤中不但可以明顯提高對(duì)腫瘤的療效，也能減輕化療產(chǎn)生的副作用，相對(duì)安全和便宜。五味子乙素作為中藥藥材五味子的成分之一[8]，具有多種生物活性，例如抗氧化、抗腫瘤、保肝等功能[9,10]。本研究以五味子乙素為活性物質(zhì)，通過(guò)體外和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討五味子乙素對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 人胃癌SNU-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 五味子乙素(20 mg，分析標(biāo)準(zhǔn)品)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司，順鉑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組。藥物用pH6.8的磷酸鹽緩沖液分別配置濃度為1 000 μg/ml儲(chǔ)備液；非放射性NF-κB EMSA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Caspase-GlooR3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司；小牛血清購(gòu)買于賽齊(上海)生物工程有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自上海賢綿生物；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海哈靈生物；FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自默沙克生物等。

1.1.3儀器 pHS-3C型酸度計(jì)購(gòu)自上海雷磁儀器廠；FACSAria型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dikinson公司；HERAcell240二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；Multiskan MK3型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自芬蘭Labsystems公司等。

1.2方法

1.2.1胃癌SNU-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 在96孔板的每孔中加入200 μl對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-1細(xì)胞，大約1×105/孔，培養(yǎng)基中分別加入10、50和100 μg/ml的五味子乙素和順鉑，培養(yǎng)24 h后，取20 μl的 MTT試劑(5 mg/ml)加入到每孔中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸出培養(yǎng)基，并加入150 μl 的DMSO試劑，充分振蕩，待完全溶解結(jié)晶后，測(cè)定570 nm處的吸光度。計(jì)算：細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%[11]。

1.2.2胃癌SNU-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制能力測(cè)定 在Transwell小室中加入2.5×105ml-1的重懸浮細(xì)胞，在上室中分別加入10、50和100 μg/ml的五味子乙素和順鉑培養(yǎng)基，每個(gè)藥物3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，每孔中加入100 μl細(xì)胞懸浮液。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)24 h。取出小室后，立即PBS溶液對(duì)濾膜進(jìn)行沖洗，并擦除上室的SNU-1細(xì)胞，之后進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)，計(jì)算SNU-1細(xì)胞的侵襲能力[12]。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡 在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在96孔板每孔中加入200 μl的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SNU-1細(xì)胞，大約1×105/孔，進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，分別加入10、50、100 μg/ml的五味子乙素培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用PBS重新懸浮細(xì)胞，按照Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)[13]。

1.2.4胃癌SNU-1細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在96孔板的每孔中加入200 μl的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SNU-1細(xì)胞，大約1×105/孔，在培養(yǎng)48 h后，分別加入 0、10、50、100 μg/ml的五味子乙素培養(yǎng)基。加入400 μl DCFH-DA(二氯氫化熒光素，10 μg/ml)，充分混勻后，避光孵育15 min后。用 PBS洗去細(xì)胞外熒光劑。并用PBS重懸細(xì)胞10 min后對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.2.5Western blot法檢測(cè)胃癌SNU-1細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和MMP-9的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-1細(xì)胞，對(duì)空白對(duì)照組和五味子乙素組處理24 h后, 對(duì)各組細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取,并通過(guò)Bradford 的方法對(duì)各檢測(cè)項(xiàng)的蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整,電泳結(jié)束后，根據(jù)分子量收集所需蛋白條帶,并根據(jù)pierce公司W(wǎng)estern blot 顯像試劑盒的指導(dǎo)說(shuō)明進(jìn)行蛋白的NC 膜電轉(zhuǎn),蛋白封閉和一抗結(jié)合,一抗結(jié)合后洗脫,之后進(jìn)行二抗孵育，二抗為免抗大鼠的多克隆抗體。ECL 試劑盒顯色后,暗室發(fā)光拍照,以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行系統(tǒng)軟件分析[14],蛋白表達(dá)率= 實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)量/GAPDH 表達(dá)量×100%。

2 結(jié)果

2.1五味子乙素對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 如表1所示，解析五味子乙素和順鉑對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，與空白對(duì)照組比較，隨著五味子乙素和順鉑濃度的增加，五味子乙素和順鉑對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率在不斷地增加，且細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力在不斷地降低，差異都具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2五味子乙素對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡，表2結(jié)果顯示：隨著五味子乙素組濃度的增加(10、50、100 μg/ml)，胃癌SNU-1細(xì)胞的凋亡率在不斷增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)濃度增加到100 μg/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡率為(83.03±1.42)%，可見(jiàn)在五味子乙素干預(yù)下，誘導(dǎo)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。

2.3五味子乙素誘導(dǎo)的胃癌SNU-1細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生 用不同濃度五味子乙素和順鉑作用胃癌SNU-1細(xì)胞48 h 后，表3所示，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨順鉑濃度的增加變化不大，而隨著五味子乙素濃度的增加而增加，在100 μg/ml濃度的五味子乙素作用下引起的ROS百分率達(dá)到了(58.54±4.26)%，與空白對(duì)照組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1五味子乙素對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的抑制作用

Tab.1InhibitoryeffectongrowthandinvasionabilitiesofSNU-1cellofsalidrosideB

GroupsDose(μg/ml)Growthinhibitionrate(%)Transferability(%)Control00.09±0.0199.96±4.11Cisplatin107.21±1.221)84.58±4.551)5031.67±2.972)46.55±5.322)10055.31±6.582)29.88±3.612)SalidrosideB1015.57±1.882)69.42±3.532)5044.56±2.592)33.58±3.752)10065.15±3.572)18.59±1.762)

Note：Compared with control group,1)P<0.05,2)P<0.01.

表2各組胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡率

Tab.2ApoptosisratesofSNU-1cellsineachgroup

GroupsDose(μg/ml)Apoptosisrate(%)Control2.41±0.23SalidrosideB1012.71±0.611)5066.70±1.922)10083.03±1.422)

Note：Compared with control group,1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsDose(μg/ml)ROSproductionrate(%)Control02.78±0.65Cisplatin103.09±0.51503.11±0.211003.13±0.37SalidrosideB1010.98±1.951)5032.75±3.112)10058.54±4.262)

Note：Compared with control group,1)P<0.05,2)P<0.01.

2.4胃癌SNU-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 如圖1、表4，在不同濃度五味子乙素的作用下，與空白對(duì)照組相比，隨著五味子乙素濃度的增加，Caspase-3和Bax的表達(dá)呈不斷增加趨勢(shì)。Bcl-2的表達(dá)呈現(xiàn)不斷減少的趨勢(shì)，都具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5胃癌SNU-1細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá) 如圖2、表5，與空白對(duì)照組相比，隨著五味子乙素濃度的增加，E-cadherin的表達(dá)呈不斷增加的趨勢(shì)；N-cadherin和MMP-9的表達(dá)呈現(xiàn)不斷減少的趨勢(shì)。

圖1 五味子乙素誘導(dǎo)胃癌SNU-1細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系Fig.1 Dose effect relationship of SNU-1 cell apoptosis induced by salidroside B

圖2 五味子乙素對(duì)腫瘤細(xì)胞胃癌SNU-1細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Expression of related protein of salidroside B on SNU-1 cells

表4五味子乙素對(duì)胃癌細(xì)胞SNU-1中Caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Tab.4ExpressionofCaspase-3，Bcl-2andBaxofsalidrosideBonSNU-1

GroupsDose(μg/ml)Relativeexpressionofprotein(%)Caspase-3(%)Bcl-2BaxControl03.04±0.21171.45±6.2912.35±0.59SalidrosideB1036.76±2.122)93.15±5.362)114.11±3.441)5077.34±2.352)39.76±3.442)155.44±6.192)100149.54±5.152)3.58±0.462)178.56±7.232)

Note：Compared with control group,1)P<0.05,2)P<0.01.

表5五味子乙素對(duì)胃癌SNU-1細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9表達(dá)的影響

Tab.5ExpressionofE-cadherin，N-cadherinandMMP-9ofsalidrosideBonSNU-1cells

GroupsDose(μg/ml)Relativeexpressionofprotein(%)E-cadherinN-cadheinMMP-9Control02.87±0.21172.35±6.13165.35±8.12SalidrosideB1035.71±2.221)100.19±5.341)114.45±5.561)5089.34±2.351)34.45±3.321)93.45±4.331)100151.53±5.451)2.33±0.211)39.56±2.451)

Note：Compared with control group,1)P<0.01.

3 討論

ROS是由細(xì)胞內(nèi)氧代謝或外源性氧化劑產(chǎn)生的具有生物活性的氧分子[15,16]，其在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中具有重要的作用[17]，DCF熒光強(qiáng)度能夠反映出ROS的水平大小，本文考察了不同濃度的五味子乙素對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，發(fā)現(xiàn)五味子乙素可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，而試驗(yàn)中順鉑未引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，這意味著五味子乙素可能通過(guò)增加ROS水平來(lái)誘導(dǎo)SNU-1細(xì)胞的凋亡。

信號(hào)通路的下放與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移具有息息相關(guān)的聯(lián)系，報(bào)道顯示眾多癌癥預(yù)后不良反應(yīng)均與腫瘤喜好通路有關(guān)，同時(shí)腫瘤組織也會(huì)通過(guò)內(nèi)源性因子的調(diào)控促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此，阻截信號(hào)通路下放已成為腫瘤靶向治療的重要手段之一。凋亡是由多種基因嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，如Caspase和Bcl-2家族等。Caspase-3是各凋亡通路的靶蛋白[18]，凋亡途徑被激活后，引起相應(yīng)的Caspase蛋白表達(dá)水平的改變，最終都將激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能夠參與并明顯影響Caspase-3級(jí)聯(lián)凋亡途徑誘導(dǎo)的凋亡通路的表達(dá)。線粒體信號(hào)途徑是線粒體上游信號(hào)分子作用于線粒體膜，Bcl-2蛋白家族活化形成蛋白通道，線粒體PT孔開放，凋亡活性物質(zhì)釋放引起下游Caspase-3蛋白活化并作用于相應(yīng)底物引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族是Caspase的上游信號(hào)，其中Bax是促凋亡類蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白[19]，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能夠參與并明顯下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)Bax的表達(dá)，Bcl-2/Bax比值減小，因此細(xì)胞凋亡可能通過(guò)線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的，這與張艷的研究阿魏酸對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)影響趨勢(shì)是一致的[20]。

MMP-9作為MMP家族中的一員，能夠通過(guò)降解層黏連蛋白和Ⅳ、Ⅴ型膠原等成分來(lái)對(duì)腫瘤細(xì)胞基底膜成分造成破壞，因此，MMP-9在促進(jìn)細(xì)胞侵襲中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；N-cadherin通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞間的黏附性，誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移和侵襲率增加，而E-cadherin的下調(diào)會(huì)嚴(yán)重影響腫瘤細(xì)胞間的連接穩(wěn)定性，這促使了腫瘤細(xì)胞侵襲的發(fā)生[21]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能夠明顯降低胃癌細(xì)胞SNU-1的增殖和轉(zhuǎn)移能力，有效地誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞SNU-1的凋亡，這可能是由于五味子乙素能明顯降低Bcl-2/Bax的比值，增強(qiáng)Caspase-3蛋白活性，并誘導(dǎo)E-cadherin的表達(dá)增加，及N-cadherin和MMP-9的表達(dá)降低導(dǎo)致的。

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ResearchofinhibitorymechanismofsalidrosideBonproliferationandmetastasisofgastriccancerSNU-1cells

LIYue-Ling，WANGGao-Feng,PENGHong,LIHui-Chuan.

MedicalCollegeofHuangheScienceandTechnologyCollege,Zhengzhou450063,China

Objective:To investigate the related mechanism of salidroside B on proliferation and metastasis of Rhodiola glucoside glioma cell.MethodsThe inhibitory rate of salidroside B on SNU-1 cells were determined using MTT method.The effect of salidroside B on inhibiting metastasis of SNU-1 cells was determined by transwell assay.Finally the effect of expression of related proteins of SNU-1 cells was discussed.The SNU-1 cells apoptosis rate was detected by flow cytometry.ResultsThe growth inhibitory rates of SNU-1 cells were increased with the increasing of dose of salidroside B(10,50,100 μg/ml),and there were significant differenced.Apoptosis flow cytometry test results showed that SNU-1 cells apoptosis rate was increased with the increasing of dose of salidroside B(10,50,100 μg/ml).ROS levels was increased with the increase of the concentration of salidroside with significant difference.The expression of salidroside B on Caspase-3,Bax and E-cadherin of SNU-1 cells were increased,Bcl-2,N-cadherin and MMP-9 of SNU-1 cells were decreased.ConclusionThe apoptosis of SNU-1 cells may be through Caspase-3 pathway,mitochondrial pathway apoptosis cascade and the level of ROS by salidroside B,and the reduce of metastasis ability may also through the destruction of adhesion between the cells and basement membrane and increased the stability of tumor cells by salidroside B.

salidroside B;Gastric cancer SNU-1 cells;Inhibitory effect;ROS;Caspase-3；MMP-9

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.012

R735.2

A

1000-484X(2017)12-1815-05

①本文為河南省教育廳重點(diǎn)研究項(xiàng)目(No.15B350003)。

②鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，鄭州 450052。

李月靈(1978年-)，女，碩士，講師，主治醫(yī)師，主要從事兒科教育教學(xué)及臨床工作。

[收稿2017-04-28 修回2017-07-03]

(編輯 倪 鵬)