袁金海 顧學(xué)平 李 濤 李自峰 賈曉莉 魯麗莉 馬麗娟

（甘肅省臨澤縣種子管理局，臨澤 734200）

白菜型冬油菜抗寒性研究進(jìn)展

袁金海 顧學(xué)平 李 濤 李自峰 賈曉莉 魯麗莉 馬麗娟

（甘肅省臨澤縣種子管理局，臨澤 734200）

抗寒性強(qiáng)是白菜型冬油菜能夠在-32℃極端低溫下安全越冬的一個(gè)關(guān)鍵因素。由于北方寒旱區(qū)冬寒春旱，積溫不夠，一般農(nóng)作物只能一年一熟，土地利用率低。此外，北方地區(qū)冬末春初的沙塵暴和揚(yáng)沙天氣使得地區(qū)生態(tài)環(huán)境極其脆弱。因此，白菜型冬油菜抗寒品種的成功選育及推廣對(duì)提高北方地區(qū)生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的意義。文章綜述了白菜型冬油菜抗寒性的最新研究進(jìn)展，主要包括抗寒性機(jī)制研究、提高抗寒性方法及抗寒性育種等情況，以期為從事冬油菜育種工作者提供借鑒。

白菜型冬油菜；抗寒性；抗寒機(jī)理

植物抗寒性的形成源于植物長(zhǎng)期對(duì)寒冷生境條件的適應(yīng)，是在基因與環(huán)境互作的雙重條件下引起植物體內(nèi)多個(gè)信號(hào)系統(tǒng)參與抗寒應(yīng)激的綜合反應(yīng)過(guò)程。寒冷干燥是我國(guó)北方地區(qū)冬季典型的氣候特征，每年冬末春初的沙塵暴和揚(yáng)沙天氣在北方已司空見(jiàn)慣。隨著北方寒旱區(qū)冬油菜成功北移[1]，隴油系列冬油菜品種為西北這片廣袤土地生態(tài)環(huán)境的改善、輪作制度的革新、經(jīng)濟(jì)效益的增加帶來(lái)了新的希望。十幾年來(lái)，伴隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，冬油菜抗寒性機(jī)理研究也不斷深入，已經(jīng)在生理生化[2-15]、相關(guān)基因克隆[16-24]、相關(guān)激素應(yīng)答[25-30]、蛋白質(zhì)組學(xué)[31-37]等方面取得了一定成果，并在此基礎(chǔ)上提出了一系列作為鑒定其抗寒性的綜合指標(biāo)。但是，冬油菜抗寒機(jī)理形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)于明確其抗寒性的響應(yīng)模式及關(guān)鍵鏈?zhǔn)椒磻?yīng)還需進(jìn)一步深入研究。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展，想必會(huì)為相關(guān)研究提供一個(gè)新的思路。本文就冬油菜北移工作開(kāi)展以來(lái)所取得的研究成果作以總結(jié)，以期為冬油菜研究工作者提供參考和借鑒。

1 冬油菜抗寒性機(jī)制研究

1.1 細(xì)胞膜系統(tǒng)、組織含水量及花芽分化與抗寒性 研究發(fā)現(xiàn)：在植物逆境脅迫中，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化先于細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)活性的變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜通透性的改變。蓋玥等[2]研究結(jié)果表明冬油菜隨著溫度的降低，葉片細(xì)胞膜透性顯著增加，且強(qiáng)抗寒品種膜透性增幅較小。同時(shí)，為了適應(yīng)低溫脅迫，葉片組織含水量也明顯下降。張朋飛等[10]也指出，低溫脅迫下，冬油菜根部含水量呈“廠”字形變化；而花芽作為植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過(guò)渡轉(zhuǎn)變的標(biāo)志，其分化程度可以反映出品種的抗寒性強(qiáng)弱，北方寒旱區(qū)冬油菜花芽分化過(guò)程研究結(jié)果表明，與弱抗寒品種相比較，強(qiáng)抗寒品種花芽表現(xiàn)出分化早、分化速度慢的特點(diǎn)。

1.2 植株生育期及細(xì)胞酶系統(tǒng)與抗寒性 孫萬(wàn)倉(cāng)等[4]認(rèn)為可以從植物學(xué)形態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程兩方面來(lái)判斷冬油菜的抗寒性。強(qiáng)抗寒品種植株在越冬前生長(zhǎng)緩慢，作為地上部分的葉片進(jìn)入枯葉期早，根系發(fā)達(dá)，能夠?yàn)樵蕉谫A備大量的有機(jī)物，翌年返青時(shí)間晚，生長(zhǎng)發(fā)育周期長(zhǎng)。冬油菜北移（如由天水北移到張掖）后，整個(gè)生育期呈“短—長(zhǎng)—短”的特點(diǎn)，且產(chǎn)量發(fā)生較大的變化，抗寒性弱的早熟品種產(chǎn)量下降，而抗寒性強(qiáng)的晚熟品種增產(chǎn)顯著[8]。低溫條件下，白菜型冬油菜抗氧化酶活性變化與細(xì)胞冰凍狀態(tài)之間的相關(guān)性表明[11]，強(qiáng)抗寒品種在冷凍后葉片不產(chǎn)生水漬或水漬較少，其根在凍后受冷害程度較輕，弱抗寒品種則相反。蒲媛媛等[9]、劉自剛等[12]對(duì)低溫脅迫下白菜型冬油菜不同抗寒品種的生理特性研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，強(qiáng)抗寒和弱抗寒品種油菜葉片SOD和CAT酶活性、可溶性蛋白含量、MDA含量隨溫度的降低均呈現(xiàn)先升高后下降的變化規(guī)律，且抗寒性強(qiáng)的品種能保持較高低溫SOD、CAT活性、可溶性蛋白含量和較低的MDA含量。武軍艷等[13]研究了冬油菜唯一能夠越冬的根部器官，發(fā)現(xiàn)根部相關(guān)的酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗寒性存在相關(guān)性，降溫后，各測(cè)量指標(biāo)與越冬率相關(guān)性顯著或極顯著，而降溫前，相關(guān)性則不顯著。此外，史鵬輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，可以利用同工酶譜帶對(duì)冬油菜抗寒性進(jìn)行鑒定分類，譜帶數(shù)越多且譜帶越寬的品種抗寒性越強(qiáng)。

1.3 光合特性與抗寒性 光合速率作為衡量植物生長(zhǎng)發(fā)育狀況的重要指標(biāo)，能夠直接反映植物受逆境脅迫的程度。植物光合器官對(duì)低溫反應(yīng)靈敏，劉自剛等[12]研究夜間低溫對(duì)白菜型冬油菜光合機(jī)構(gòu)的影響結(jié)果表明，夜間溫度降至5℃處理7d后，不同抗寒品種氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、凈光合速率（Pn）均下降，且弱抗寒品種葉片氣孔大多數(shù)處于半開(kāi)半閉的狀態(tài)，而強(qiáng)抗寒品種氣孔仍然保持著完全開(kāi)放的狀態(tài)，其光合速率、根冠比、根部干物質(zhì)積累均顯著高于弱抗寒品種。研究發(fā)現(xiàn)，葉片柵欄組織與海綿組織比例，海綿組織厚度，葉片厚度，葉片上、下表皮厚度，葉片氣孔的密度及大小與植物抗寒性密切相關(guān)。許耀照等[15]對(duì)冬油菜葉片解剖結(jié)構(gòu)研究指出白菜型冬油菜在冬前低溫條件下無(wú)光合午休現(xiàn)象，且Pn變化表現(xiàn)為“單峰”曲線，同時(shí)強(qiáng)抗寒品種葉片組織結(jié)構(gòu)（氣孔密度、面積、周長(zhǎng)等）變幅較小，光抑制程度較強(qiáng)。低溫條件下，氣孔對(duì)大氣濕度和光照反應(yīng)不敏感，導(dǎo)致植物氣孔密度變小，長(zhǎng)度變短，有利于植物在低溫脅迫下維持較高的組織含水量，提高水分利用率。

1.4 植物激素與抗寒性 生產(chǎn)上常采用控制植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（植物激素）來(lái)提高作物的抗寒性，通過(guò)借鑒前人的研究經(jīng)驗(yàn)，利用植物激素進(jìn)行抗寒性的研究在冬油菜生產(chǎn)上得到了進(jìn)一步應(yīng)用。方彥等[25]冬油菜浸種試驗(yàn)表明，30mg/L濃度的ABA是冬油菜抗寒性最佳誘導(dǎo)劑。張騰國(guó)等[38]認(rèn)為MAPKK抑制劑能夠通過(guò)控制冬油菜光合作用，改變相關(guān)酶的表達(dá)活性提高植株抗寒能力。劉海卿等[28]通過(guò)冬油菜不同葉齡期噴施一定濃度的外源ABA研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的ABA能夠明顯提高冬油菜的越冬率，且在6葉期噴施條件下抗寒性提高最為顯著，進(jìn)一步豐富了武軍艷等[26]的前期研究結(jié)果。隨著研究的深入，最終確定了冬油菜葉片最佳的外源ABA噴施濃度為20mg/L[27]。陳奇等[30]在自然降溫過(guò)程中測(cè)定了冬油菜6個(gè)溫度（25℃、12℃、8℃、3℃、-1℃、-4℃）梯度下內(nèi)源激素ABA、GA3、IAA、ZR含量及其比值的變化，試驗(yàn)結(jié)果表明：較高的ABA含量和較低的GA3、IAA、ZR含量能夠促進(jìn)冬油菜抗寒性的形成，進(jìn)而提高其抗寒能力。

1.5 抗寒相關(guān)基因與抗寒性 曾秀存等[16-18]研究發(fā)現(xiàn)，白菜型冬油菜的抗寒性的增強(qiáng)，主要受APX基因、Fe-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因的調(diào)控表達(dá)。半定量RT-PCR及酶活性分析表明，APX基因、Fe-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)量伴隨著低溫程度的逐級(jí)加劇，均呈“上升—下降—上升”的趨勢(shì)，與實(shí)際生產(chǎn)中田間冬油菜的生長(zhǎng)習(xí)性相吻合，說(shuō)明APX基因、Fe-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因?qū)儆诘蜏卣T導(dǎo)表達(dá)的抗逆基因。張騰國(guó)等[19-22]利用RACE技術(shù)從隴油6號(hào)中分別克隆了BnICE1、BnMKK4、CBF、COR、BnMKK2、BnMPK6 和MKK2基因，實(shí)時(shí)熒光定量表明BnICE1的轉(zhuǎn)錄受到低溫脅迫誘導(dǎo)，在油菜抵御寒冷等環(huán)境脅迫的過(guò)程中發(fā)揮作用。馬驪等[23]研究發(fā)現(xiàn)白菜型冬油菜BnCOR25、BnICE1和Cu/Zn-SOD基因在低溫下被誘導(dǎo)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量隨溫度的降低均上升，且均在-4℃時(shí)到達(dá)峰值。后來(lái)本課題組利用雙向電泳對(duì)分離出的類甜蛋白進(jìn)行了基因克隆和表達(dá)分析[24]，其結(jié)果與曾秀存等[16-18]抗寒性分析試驗(yàn)結(jié)果相同。

1.6 抗寒相關(guān)蛋白與抗寒性 當(dāng)植物遭受不良環(huán)境的脅迫時(shí)，作為植物體的第一道天然屏障——質(zhì)外體，為了響應(yīng)逆境脅迫，從而激發(fā)質(zhì)外體信號(hào)系統(tǒng)的表達(dá)，以此來(lái)抵御相關(guān)的外來(lái)脅迫。袁金海等[33]對(duì)冬油菜質(zhì)外體蛋白的提取方法進(jìn)行了探究，在保證高提取率和低污染率的情況下明確了適合冬油菜質(zhì)外體蛋白的提取方法，為進(jìn)一步研究抗寒相關(guān)蛋白奠定了基礎(chǔ)。

抗凍蛋白（AFPs）是一類具有抑制胞內(nèi)冰晶形成且對(duì)已經(jīng)形成的冰晶具有抑制其體積繼續(xù)增大的抗凍活性物質(zhì)。1992年，M.Griffith等[39]第一次從經(jīng)低溫鍛煉的冬黑麥葉片質(zhì)外體中得到并部分純化了AFPs，開(kāi)啟了植物抗凍蛋白的研究。受前人研究的啟發(fā)，史鵬輝[31]從冬油菜隴油6號(hào)的葉片及根部提取了質(zhì)外體蛋白，電泳結(jié)果表明在33～45kD之間出現(xiàn)了一條特異性條帶，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定為β-1，3-葡聚糖酶，該酶在冬黑麥中已被證明為抗凍蛋白，具有冰晶修飾活性。楊剛等[32]對(duì)經(jīng)過(guò)冷馴化的隴油6號(hào)葉片和根部質(zhì)外體蛋白提取液進(jìn)行活性分析發(fā)現(xiàn)，冷馴化后其提取液具有極強(qiáng)的冰晶抑制活性。劉自剛等[34]比較了-20℃條件貯存的經(jīng)過(guò)低溫處理的隴油7號(hào)葉片質(zhì)外體蛋白提取液冰晶形態(tài)，再次證明和豐富了課題組先前的研究結(jié)果，向更加精準(zhǔn)地明確冬油菜的抗寒機(jī)理邁進(jìn)了可喜的一步。

目前，雙向電泳技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首選技術(shù)，在研究作物抗逆性差異蛋白質(zhì)的分析及鑒定中越來(lái)越受到研究者的青睞。陳奇等[35]在蒲媛媛[36]的研究基礎(chǔ)上首次對(duì)適合于冬油菜雙向電泳技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并且分離出了白菜型冬油菜隴油7號(hào)響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵蛋白——類甜蛋白。袁金海等[37]模擬我國(guó)北方初春顯著的倒春寒現(xiàn)象，利用雙向電泳技術(shù)成功分離出了雙半胱氨酸型氧化還原蛋白酶過(guò)氧化物酶（2-Cysperoxiredoxin），為進(jìn)一步明確冬油菜響應(yīng)反復(fù)低溫脅迫與恢復(fù)的氣候條件機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。

通過(guò)以上研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，白菜型冬油菜響應(yīng)抗寒機(jī)制模式如下（圖1）。

2 冬油菜抗寒性提高方法與措施

圖1 白菜型冬油菜響應(yīng)抗寒機(jī)制模式

目前，隨著一系列超強(qiáng)抗寒品種的成功選育，以隴油6號(hào)、隴油7號(hào)為典型代表的品種得到大范圍的應(yīng)用和推廣，研究表明，可以通過(guò)采用覆蓋處理、改變施肥方式、調(diào)整播期、控制群體密度、激素浸種、化學(xué)誘變劑處理、葉面噴施激素等提高冬油菜的越冬率和抗寒性。孫萬(wàn)倉(cāng)等[3]研究發(fā)現(xiàn)，甘肅中部、北部露地栽培的冬油菜越冬率為77%，通過(guò)不同覆蓋方式處理，其越冬率較露地提高1.3%～19.0%，且覆蓋效果表現(xiàn)為地膜覆蓋＞秸稈覆蓋＞農(nóng)家肥+土覆蓋＞農(nóng)家肥覆蓋，說(shuō)明覆蓋處理對(duì)冬油菜具有良好的保墑防凍作用。曾軍等[5]研究結(jié)果表明，科學(xué)合理的施肥方式能夠最大限度的保證冬油菜安全越冬，冬前施種肥、冬前追肥以及冬前施種肥和冬前追肥的施肥方式對(duì)冬油菜的生長(zhǎng)發(fā)育有著顯著的影響，通過(guò)不同的施肥方式處理，冬油菜的越冬率可提高2～3個(gè)百分點(diǎn)。春化對(duì)冬油菜花芽分化有著顯著的影響，這主要表現(xiàn)在適宜播期的確定，燕妮等[6]認(rèn)為，適期早播可提高冬油菜的越冬率，主要原因?yàn)椴煌テ趯?dǎo)致冬油菜的苗齡不同，進(jìn)而影響其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和細(xì)胞保護(hù)性酶活性等生理生化特性的變化程度不同。葉劍等[7]指出，合理的種植密度能夠提高冬油菜的壯苗率，有利于其安全越冬，在種植密度為60萬(wàn)株/hm2的情況下越冬率為89%，當(dāng)種植密度擴(kuò)大1倍（120萬(wàn)株/hm2）時(shí)，其越冬率反而降為80%，由此可見(jiàn)，合理的種植密度也是提高冬油菜越冬率的關(guān)鍵技術(shù)之一。方彥等[25]研究了不同濃度ABA浸種對(duì)冬油菜抗寒性的誘導(dǎo)效應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果表明冬油菜抗寒性的提高主要借助于ABA能誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)酶活性的變化，進(jìn)而通過(guò)酶系統(tǒng)的連鎖反應(yīng)來(lái)減輕低溫對(duì)細(xì)胞的傷害程度?；瘜W(xué)誘變劑在提高作物抗逆性方面已得到了大量的應(yīng)用，課題組發(fā)現(xiàn)，一定體積分?jǐn)?shù)的EMS誘變劑能提高細(xì)胞膜保護(hù)酶活性，酶活性越高消除氧自由基的能力越強(qiáng)，從而提高冬油菜對(duì)低溫的耐受能力[40]。武軍艷等[26-27]、劉海卿等[28-29]對(duì)利用葉面噴施激素提高冬油菜抗寒性技術(shù)進(jìn)行了多年研究，表明外源ABA能夠顯著提高細(xì)胞保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理生化物質(zhì)含量，緩解零下低溫對(duì)冬油菜的凍害；郭仁迪等[41]在此基礎(chǔ)上，研制出了適宜于提高冬油菜抗寒性的新型抗寒復(fù)合劑（20mg/L ABA+300mg/L PEG-6000+50mg/L PP333），其對(duì)冬油菜越冬率較對(duì)照提高18.87個(gè)百分點(diǎn)，產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)系數(shù)增加顯著。

3 抗寒性育種成就

選擇更寒冷的生態(tài)環(huán)境和抗寒性強(qiáng)的基因型進(jìn)行輪回選擇是改良北方冬油菜抗寒性的有效途徑[42]，目前，生產(chǎn)上應(yīng)用和推廣的抗寒豐產(chǎn)良種隴油系列品種都是通過(guò)輪回選擇育成的。植物的抗寒性是由多基因控制下的數(shù)量性狀不斷累積并逐漸提高，孫萬(wàn)倉(cāng)科研團(tuán)隊(duì)成功培育的隴油6號(hào)、隴油7號(hào)等隴油系列超強(qiáng)抗寒品種可耐-32℃，其抗寒性已達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。隴油6號(hào)等抗寒品種的選育，把我國(guó)冬油菜種植范圍由35°N向北推至40°N～48°N，向北推移了5～13個(gè)緯度，打破了業(yè)內(nèi)人士關(guān)于我國(guó)原有冬春油菜產(chǎn)區(qū)呈似“廠”型的分界線，對(duì)我國(guó)油菜產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了重新區(qū)劃。楊建勝等[40]研究了經(jīng)EMS處理的隴油7號(hào)種子，其生育期各項(xiàng)生理指標(biāo)表明EMS能夠提高冬油菜的抗寒性?？购缡炱贩N隴油9號(hào)的選育更大程度地滿足了我國(guó)北方一年多熟的耕作制度。今天，在國(guó)家“一帶一路”偉大戰(zhàn)略背景下，在以“生態(tài)文明”為時(shí)代主題的號(hào)召下，冬油菜種植和推廣將會(huì)帶來(lái)更加顯著的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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張掖國(guó)家級(jí)玉米種子生產(chǎn)基地（臨澤）項(xiàng)目

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