張少平，徐呈祥，李超群，鄭福慶

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

檀香紫檀苗木炭疽病病原菌分離鑒定

張少平，徐呈祥，李超群，鄭福慶

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

在檀香紫檀引種繁育中，發(fā)現(xiàn)其溫室中的苗木冬春時節(jié)發(fā)生一種較嚴(yán)重的葉部病害，但病害名稱、病原菌種類未見報道。以感染該病害的18月齡苗木為試材，分離純化后獲得病原菌株，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進(jìn)行鑒定。根據(jù)分離到的該菌株菌落形態(tài)特征、分生孢子形態(tài)特征及病原菌rDNA-ITS 序列測試分析結(jié)果，確定分離到的菌株為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）；致病性試驗結(jié)果表明，膠孢炭疽菌是導(dǎo)致檀香紫檀葉片該種病害的病原菌，但屬非典型炭疽病。討論了檀香紫檀苗木炭疽病的防控。

檀香紫檀；葉部病害；病原菌；分離鑒定；膠孢炭疽菌

珍貴用材樹種，特別是紅木樹種及其森林資源，已經(jīng)成為國家重要戰(zhàn)略資源和國際木材市場的競爭焦點［1］。檀香紫檀（Pterocarpus santalinus）是蝶形花科紫檀屬樹種，別名小葉紫檀，自然分布于熱帶原始森林，木材以印度邁索爾地區(qū)和緬甸北部地區(qū)出產(chǎn)的最著名，是真正被稱為“紫檀木”的紅木木材，在紅木中最為珍稀，品質(zhì)和售價遠(yuǎn)高于“花梨木”［2］。檀香紫檀原產(chǎn)地不在中國，中國是引種栽培國，但50多年的引種實踐表明中國熱帶和南亞熱帶地區(qū)對該樹種的引種是成功的，表現(xiàn)優(yōu)良［3］。在紫檀屬各樹種中檀香紫檀抗寒性相對最強(qiáng)，在緯度更高地區(qū)引種推廣潛力更大，但迄今該種紫檀僅在海南省儋州、尖峰嶺有少量成年大樹，苗木稀缺，繁育技術(shù)尚不成熟［4-5］。在實生繁殖中，我們發(fā)現(xiàn)溫室中培育的檀香紫檀苗木葉部常發(fā)生一種侵染性病害，嚴(yán)重抑制生長，可致整株落葉甚至死亡。該樹種葉部病害，露地栽培的檀香紫檀苗木也有發(fā)生，但危害程度輕微。目前，檀香紫檀繁育及栽培文獻(xiàn)稀少，未見有其病害及防控的研究，該病害的名稱、病原菌種類尚不清楚。為此，我們進(jìn)行了本項研究。

1 材料與方法

檀香紫檀種子引種自海南熱帶植物園，播種繁育成18月齡苗木。病害主要發(fā)生在冬春時節(jié)，早期主要是在葉片先端出現(xiàn)水漬狀病斑，繼之中心部位失水干枯、呈同心輪紋狀擴(kuò)大，后期葉片基部也發(fā)生病害，蔓延速度很快，發(fā)病重時導(dǎo)致整個葉片干枯、脫落，甚至整株枯死（圖1）。

圖1 檀香紫檀苗木葉片病害發(fā)病癥狀

病原菌分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定：在具有明顯染病癥狀的病葉組織病健交界處剪取5mm×5mm病組織，表面消毒后置于PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后，對菌落進(jìn)行純化并單孢分離，選取代表性菌株移接置PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)6 d后，記錄菌落形態(tài)學(xué)特征，并對病原菌分生孢子進(jìn)行顯微形態(tài)觀測、拍照［6-7］。

病原菌致病性檢測：選取無機(jī)械損傷，無病蟲害、長勢強(qiáng)健、未離體葉片做致病力檢測材料，在無菌操作室環(huán)境中，用無菌水沖洗葉片3次，然后，將分離獲得的菌株孢子用微量注射器針刺接種到健康葉片上，以滅菌蒸餾水為對照。接種病原菌的檀香紫檀苗木，在無菌室中培養(yǎng)、觀察，自然光照。

病原菌DNA提?。喊?.0 g樣品加入4 mL（65℃）2% CTAB提取液。加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）。轉(zhuǎn)移上清液，加入等體積氯仿/異戊醇，12 000 r/min 離心10 min（4℃，重復(fù)操作）。向上清中加入2倍體積無水乙醇（可加入1/10 體積 3 mol/L NaAc（pH5.2）），充分混勻，使 DNA 析出，12 000 r/min離心 20 m，棄上清后加入500 μL70℅乙醇，12 000 r/min離心5 min后再用500 μL70%乙醇洗滌，-20℃保存［8］。

病原菌rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增：選擇真菌rDNA-ITS通用引物。ITS1：5′-TCC GTA GGT GAACCT GCG G-3′；ITS4 ：5′-TCC TCC GCT TATTGA TAT GC-3′。反應(yīng)體系如下：ddH2O 16.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ITS1和 ITS4各 1 μL，Taq 酶 1μL，模板DNA1.0 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱 5 min，94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 50 s，重復(fù)30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物測序由廣州華大基因有限公司完成［9］。

病原菌rDNA-ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將DNA序列測序結(jié)果提交到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST數(shù)據(jù)分析，利用ClustalX和MEGA5.1軟件對所得序列及選取的參比菌株的rDNA-ITS 基因進(jìn)行同源性分析、并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［10］。

2 結(jié)果及分析

2.1 病原菌的致病性

將純化后的病原菌接種到健康、無機(jī)械損傷的檀香紫檀苗木葉片上，接種7 d內(nèi)葉片表現(xiàn)出感病癥狀即與田間栽培植株的相同。接種后不同時間葉片病癥：接種1 d：接種病原菌處的傷口出現(xiàn)黃褐色斑點；接種3 d：接種口周圍黃褐色斑點數(shù)量增多；接種5 d：黃褐色斑點面積明顯增大，各個斑點逐漸連接成片；接種7 d：黃褐色色斑除接種部位外基本感染葉片整個邊緣部分；接種9 d：黃褐色色斑從葉片邊緣向葉片中央擴(kuò)展，相鄰未接種葉片出現(xiàn)類似癥狀；接種12 d：距黃褐色色斑較遠(yuǎn)的葉片，從葉緣開始產(chǎn)生與被接種葉片相似的黃褐色斑塊；接種15 d：被接種葉片整片變?yōu)辄S褐色，被感染的未接種病原菌葉片類似癥狀加重。在接種15 d內(nèi)，對照葉片的接種口及其周圍無任何顯著變化（圖2）。這些結(jié)果表明，純化得到的菌株與實際侵染的病菌一致，且病原菌致病性強(qiáng)、蔓延很快。用發(fā)病的病斑進(jìn)行常規(guī)分離，再次獲得與原分離菌一致的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為檀香紫檀苗木葉片病害的病原菌。

圖2 檀香紫檀葉片接種分離出病原菌 （L1）后的癥狀

2.2 病原菌的形態(tài)

分離純化到的病原菌株，初生菌絲為白色，比較疏松，生長3～4 d后加粗；菌落呈圓形，邊緣較整齊，淺褐色或黑褐色；菌落背面邊緣灰白色，中間深灰色，菌絲疏水性極強(qiáng)。生長10～15 d，菌絲轉(zhuǎn)為鼠灰色，產(chǎn)生黑色顆粒，培養(yǎng)基背面呈黑褐色。分生孢子盤初期多為圓形、黑褐色，后期可由若干個小分生孢子盤聯(lián)合成大型分生孢子盤，有時也產(chǎn)生單個近球狀的大型分生孢子盤，無色有隔菌絲。分生孢子圓形或長橢圓形，單胞無色，在PDA培養(yǎng)基上，產(chǎn)孢量低（圖3）。根據(jù)這些形態(tài)特征判斷，致病病原菌可能屬于炭疽菌屬（Colletotrichum Corda）真菌。

圖3 分離純化后獲得的病原菌（L1）顯微形態(tài)

2.3 病原菌 rDNA-ITS序列同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

由圖4（左）的DNA凝膠電泳圖譜可見，條帶清晰，表明成功提取了病原菌的DNA組，獲得的DNA質(zhì)量符合后續(xù)研究要求。以所得DNA為模板，進(jìn)行rDNA-ITS PCR擴(kuò)增的結(jié)果見圖4（右）。經(jīng)測序，所得rDNA-ITS序列的長度為550 bp。將獲得的核酸序列提交到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST在線分析和序列同源性比較，將菌株L1 rDNA-ITS序列與GenBank中已有的 DNA序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)GenBank中的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）ITS序列同源性均為100%，從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載炭疽菌模式菌株ITS序列作為參考序列，以C. hippeastri ICMP17920、C. boninensen ICMP10338為外群參考序列，利用MEGA5.1構(gòu)建了不同種炭疽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹［7-8］，聚類分析結(jié)果表明病原菌株rDNA-ITS的序列與膠孢炭疽菌模式菌株C. gloeosporioides ICMP18738，C. gloeosporioides ICMP17821位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，自展支持率為95%（圖5），而與其他炭疽菌遺傳距離較遠(yuǎn)。根據(jù)病原菌菌落和分生孢子的形態(tài)特征以及 ITS 序列同源性比較的結(jié)果，確定檀香紫檀葉部病害的病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

圖4 病原菌（L1）基因組DNA電泳結(jié)果（左）及rDNA-ITS 序列PCR擴(kuò)增結(jié)果（右）

3 討論

膠孢炭疽菌是重要病原菌，侵染危害多種樹木［11］。對炭疽菌的分類較為困難，其菌絲和菌落在不同種類培養(yǎng)基及環(huán)境條件下形態(tài)差異大［12-13］。形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)相結(jié)合在炭疽菌分類中具重要作用?；趓DNA基因編碼序列將真菌種群間的親緣關(guān)系從遺傳進(jìn)化角度加以區(qū)分，較能反映真菌間的遺傳關(guān)系。本研究以病原菌形態(tài)特征和生物學(xué)特征以及寄主范圍，并結(jié)合rDNA-ITS序列進(jìn)行分析和比對，對檀香紫檀一種嚴(yán)重的葉部病害的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定，證明其為炭疽菌屬膠孢炭疽菌，這在檀香紫檀上系首次報道，對其繁育和栽培有突出意義。但是，從苗圃地及接種后的病癥圖片看，該病害應(yīng)屬非典型的炭疽病癥狀。由于膠孢炭疽菌是一個很大的類群，我們計劃對該分離物進(jìn)行更多植物種類的致病性分析。

圖5 基于炭疽菌rDNA-ITS序列的病原菌株（L1）系統(tǒng)發(fā)育樹

環(huán)境條件，包括氣候因子和管理措施，與樹木炭疽病菌發(fā)生和危害密切相關(guān)［14］。我們對檀香紫檀葉片膠胞炭疽病菌生物學(xué)特性的試驗研究表明，其在溫度為26～30℃、相對濕度為90%～95%的環(huán)境中蔓延最迅速，表現(xiàn)規(guī)律同這種病害在室內(nèi)外的差異一致，啟示其幼齡苗木在溫室或塑料大棚中越冬應(yīng)首先注意調(diào)控環(huán)境條件以使育苗設(shè)施中有良好的光照和通氣狀況以及較低的相對濕度。目前，防治膠孢炭疽病菌主要用百菌清、多菌靈、代森錳鋅、甲基托布津，但易產(chǎn)生抗藥性［15］。我們對導(dǎo)致檀香紫檀葉片發(fā)生嚴(yán)重病害的膠孢炭疽菌適宜的化防農(nóng)藥進(jìn)行試驗，前述4種藥劑均具有良好防效，且越早防治效果越好，但0.225 g/L咪鮮胺錳鹽防效更好。

［1］ 黎云昆. 論我國珍貴用材樹種資源的培育［J］.綠色中國，2005（8）：24-28.

［2］ 徐呈祥. 中國紅木樹種引種栽培研究進(jìn)展［J］.世界林業(yè)研究，2011，24（6）：65-71.

［3］ Xu C X，Zeng J，Ma Y P，et al. Introduction，growth performance and ecological adaptability of Hongmu tree species（Pterocarpus Spp.）in China［J］. Journal of Tropical Forest Science，2016，28（3）：260-267.

［4］ 馬艷萍. 中國紫檀研究的文獻(xiàn)計量學(xué)分析［J］.農(nóng)業(yè)圖書情報學(xué)刊，2013，25（6）：49-51.

［5］ 馬艷萍，徐呈祥，崔鐵成，等. 紅木和紅木樹種生物學(xué)研究文獻(xiàn)分析［J］. 熱帶林業(yè)，2015，43（3）：46-49.

［6］ 徐成楠，王亞南，胡同樂，等. 藍(lán)莓炭疽病病原菌鑒定及致病性測定［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（20）：3992-3998.

［7］ 陳汝，王金政，薛曉敏，等. 紅富士蘋果果實炭疽病病菌的分離與鑒定［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（11）：79-81.

［8］ 吳良慶，朱立武，衡偉，等. 碭山梨炭疽病病原鑒定及其抑菌藥劑篩選［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（18）：3750-3758.

［9］ 張穎慧，魏東盛，邢來君，等. 一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法［J］. 微生物學(xué)通報，2008，35（3）：466-469.

［10］ Chen L S，Chu C，Liu C D，et al. PCR-based detection and differentiation of anthracnose pathogens，Colletotrichum gloeosporioides and C. truncatum，from vegetable soybean in Taiwan［J］. Journal of Phytopathology，2006，154（12）：654-662.

［11］ Liu F，Damm U，Cai L，et al. Species of the Colletotrichum gloeosporioides complex associated with anthracnose diseases of Proteaceae［J］.Fungal Diversity，2013，61（1）：89-105.

［12］ 朱輝，覃偉權(quán)，付登強(qiáng)，等. 海南油茶炭疽病病原鑒定及生物學(xué)特性研究［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42（16）：54-59.

［13］ Gupta V K，Pandey A，Kumar P，et al. Genetic character-ization of mango anthracnose pathogen Colletotrichum gloeosporioides Penz. by random amplified polymorphic DNA analysis［J］.African Journal of Biotechnology，2010，9（26）：4009-4013.

［14］ 宋丹丹，張伊瑩，張琳婧，等. 楊樹炭疽病菌對多菌靈及3種DMIs殺菌劑的敏感性［J］. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2016，18（5）：567-574.

［15］ 歐雄常，柳鳳，昝麗梅. 熱帶水果采后炭疽病生物防治研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29（5）：74-79.

Pathogen isolation and identification of a leaf disease of red sandalwood （Pterocarpus santalinus） seedlings

ZHANG Shao-ping，XU Cheng-xiang，LI Chao-qun，ZHENG Fu-qing
（College of Life Sciences，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China）

In the introduction and propagation of red sandalwood （Pterocarpus santalinus），we found a serious leaf disease of its seedlings in winter and spring seasons，but the name of the disease and its pathogen species have not been reported. The pathogen isolated from infected leaves of 18-month-old seedlings was identified as Colletotrichum gloeosporioides by morphological characteristics of colony and conidium，and analysis results of rDNA- internal transcribed spacer sequence （ITS） of the strain. Pathogenicity test results further confirmed that C. gloeosporioides was the pathogen responsible for the infected leaves symptoms of red sandalwood，however，the disease belongs to an atypical anthracnose. Control of the leaf diseases of red sandalwood seedlings was discussed.

red sandalwood （Pterocarpus santalinus）；leaf disease；pathogen；isolation and identification；Colletotrichum gloeosporioides

S763.15

A

1004-874X（2017）08-0085-05

張少平，徐呈祥，李超群，等. 檀香紫檀苗木炭疽病病原菌分離鑒定［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（8）：85-89.

2017-06-01

國家自然科學(xué)基金（31270674）；肇慶學(xué)院創(chuàng)新強(qiáng)校重點研究平臺（CQ201607）

張少平（1976-），男，博士，講師，E-mail：zzsspp2001@163.com

徐呈祥（1963-），男，博士，教授，E-mail：xucx2013@163.com

（責(zé)任編輯 楊賢智）