冷暖,劉曉巍,張娜,許立新*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所, 北京 100083;2.南京市老山林場, 江蘇 南京 211811)

草地早熟禾干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組差異性分析

冷暖1,劉曉巍2,張娜1,許立新1*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所, 北京 100083;2.南京市老山林場, 江蘇 南京 211811)

干旱是影響草地早熟禾生產(chǎn)力的主要因素之一。在沒有參考基因組的情況下, 為了揭示草地早熟禾在干旱處理下基因表達(dá)譜的變化, 本文采用了高通量Illumina Hiseq測序平臺對草地早熟禾的對照組(CK)與干旱處理組(D)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序, 并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析研究, 進(jìn)一步探究了草地早熟禾干旱應(yīng)答的分子機(jī)制。結(jié)果表明, 在干旱處理下共檢測到24465個差異表達(dá)的基因, 篩選后獲得4143個上調(diào)基因和4415個下調(diào)基因, 共占差異表達(dá)基因總數(shù)的34.98%。經(jīng)富集分析后得, 與蛋白激酶、蛋白磷酸酶、碳代謝以及ABA等相關(guān)的基因可以作為研究草地早熟禾干旱響應(yīng)機(jī)制的主要研究對象。qRT-PCR分析表明, 隨機(jī)選出的8個差異性表達(dá)基因的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果相一致。此外, 還候選了吲哚-3-甘油磷酸合成酶、蛋白磷酸酶、已糖激酶、鈣結(jié)合蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白等基因作為與草地早熟禾干旱脅迫相關(guān)的應(yīng)答候選基因, 為揭示草地早熟禾耐旱分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

草地早熟禾；干旱脅迫；高通量測序；轉(zhuǎn)錄組

在我國北方, 草地早熟禾是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的冷季型草, 品質(zhì)好, 繁殖快, 廣泛應(yīng)用于公園、居住區(qū)、運(yùn)動場等地綠化。但我國北方大部分地區(qū)為干旱半干旱地區(qū), 不同地區(qū)面臨著不同程度的缺水問題, 所以干旱成為影響草地早熟禾在北方生長發(fā)育的主要因素之一。水分是植物體的重要組成部分, 它參與植物的光合、呼吸、蒸騰等生理作用, 也是影響植物形態(tài)結(jié)構(gòu)等重要生物因子, 充足的水分供應(yīng)是植物正常生存的重要條件。干旱脅迫時, 植物為了適應(yīng)環(huán)境, 不僅在生理上會發(fā)生反應(yīng), 分子上也會產(chǎn)生一定的變化, 一些功能不同的基因在干旱脅迫時表達(dá)量會發(fā)生上調(diào)或者下調(diào)。李偉[1]發(fā)現(xiàn), 草地早熟禾(Poapratensis)PpNAC與水稻(Oryzasativa)的NAC蛋白SNACI高度同源, 水稻的SNACI可使植株抗旱性提高, 因而推測PpNAC與草地早熟禾的抗旱性有密切聯(lián)系；Xu[2]發(fā)現(xiàn), 干旱會誘導(dǎo)草地早熟禾兩個品種‘Midnight’和‘Brilliant’的Cyt Cu/ZnSOD、Chl Cu/ZnSOD和APX三個基因上調(diào)表達(dá), MR基因下調(diào)表達(dá), 且與‘Brilliant’相比, 抗旱性好的‘Midnight’品種這4個基因差異表達(dá)更顯著；信金娜[3]通過基因槍轟擊法把抗旱、耐鹽有關(guān)外源基因(DREB1A、BADH-CMO、CMO)轉(zhuǎn)入草地早熟禾, 獲得轉(zhuǎn)基因植株, 結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因植株在抗旱性方面強(qiáng)弱程度為轉(zhuǎn)雙基因植株>轉(zhuǎn)DREB1A、CMO基因植株>對照?？购敌允且粋€多基因控制的數(shù)量性狀[4], 因而有很多優(yōu)良基因還沒有能夠完全被準(zhǔn)確探明。

Illumina測序?qū)儆诙鷾y序技術(shù), 它是基于特定限制酶切位點(diǎn)的測序分析, 不需要知道基因組序列, 適于研究基因組不明確的物種的基因表達(dá)[5], 并且具有測序通量大、成本低的優(yōu)勢。目前, 在黑麥草(Loliumspp.)[6]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[7]、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)[8-9]以及草地早熟禾[10]的研究中都有應(yīng)用, 通過測序技術(shù)獲得草坪草不同脅迫環(huán)境的響應(yīng)基因并進(jìn)行基因表達(dá)差異性分析。因此, Illumina測序技術(shù)是研究草地早熟禾干旱脅迫基因差異表達(dá)較好的選擇。

本研究中運(yùn)用Illumina高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù), 分別對正常水分條件和干旱條件下生長的草地早熟禾成熟葉片的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn)行測序,測得的數(shù)據(jù)能夠較全面反映草地早熟禾干旱脅迫下基因表達(dá)狀況, 分別對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋和富集分析, 進(jìn)一步篩選出與草地早熟禾抗旱相關(guān)的基因, 為之后草地早熟禾SSR標(biāo)記開發(fā)、抗旱性相關(guān)基因的發(fā)掘及分子育種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

以草地早熟禾的‘Nuglade’品種為材料, 購自北京綠冠公司。草坪養(yǎng)護(hù)在北京林業(yè)大學(xué)八家村實(shí)驗(yàn)站溫室中進(jìn)行。試驗(yàn)于2016年1月開始,設(shè)置兩種處理, 對照處理和干旱脅迫處理。對照處理的植株2 d澆一次水, 保證土壤含水量在35%；干旱脅迫處理組不澆水, 直至土壤水分降到4%。每個處理3次生物學(xué)重復(fù)。以正常澆水的材料為對照樣本(CK), 干旱脅迫為處理樣本(D)。在干旱脅迫后第15天的8:30-9:00之間對對照組(CK)和干旱處理組(D)進(jìn)行取樣。

1.2 文庫的構(gòu)建及庫檢

按照TRIzol植物RNA提取試劑盒方法分別提取草地早熟禾對照組(CK)與干旱處理組(D)樣品葉片的RNA。所提取的RNA經(jīng)電泳檢測合格后送至北京諾禾致源生物有限公司進(jìn)一步確認(rèn)質(zhì)量, 合格后利用 Oligo(dT)磁珠富集真核生物mRNA, 并以 Oligo (dT)引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA, 通過PCR擴(kuò)增和AMPure XP beads純化后獲得最終文庫。文庫構(gòu)建完成后, 使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量, 用Agilent 2100對文庫進(jìn)行檢測, 符合預(yù)期后, 使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol/L), 以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后, 進(jìn)行Illumina HiSeq測序。

1.3 Illumina測序及測序數(shù)據(jù)的分析

1.3.1測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與轉(zhuǎn)錄本拼接 高通量測序(如Illumina HiSeqTM)得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(sequenced reads), 稱之為 Raw Data或Raw Reads。通過測序錯誤率分布檢查, A/T/G/C含量分布檢查, 進(jìn)行c測序數(shù)據(jù)過濾后得到Clean Reads。對于無參考基因組的項(xiàng)目, 獲得Clean Reads后, 需要對Clean Reads進(jìn)行拼接以獲取后續(xù)分析的參考序列。采用Trinity對Clean Reads進(jìn)行拼接[11]。將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列, 作為后續(xù)分析的參考序列。取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene, 以此進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.3.2基因功能注釋 為獲得全面的基因功能信息, 進(jìn)行了七大數(shù)據(jù)庫的基因功能注釋, 包括: Nr, Nt, PFAM, KOG/COG, Swiss Prot, KEGG, GO。得出數(shù)據(jù)在七大數(shù)據(jù)庫中的注釋成功率情況。

1.3.3差異表達(dá)基因分析 統(tǒng)計(jì)好樣本中基因表達(dá)量后, 分別對對照組(CK)與干旱處理組(D)之間基因表達(dá)情況進(jìn)行對比, 找出表達(dá)量存在差異的基因, 并通過篩選進(jìn)一步發(fā)掘出顯著差異表達(dá)的基因。對于有生物學(xué)重復(fù)的樣品, 采用DESeq[12]進(jìn)行分析, 篩選閾值為p-adjusted<0.05。

1.3.4差異表達(dá)基因富集分析 GO功能顯著性富集分析給出與基因組背景相比, 在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO功能條目, 從而給出差異表達(dá)基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。GO富集分析方法為 GOseq[13],此方法基于Wallenius non-central hyper-geometric distribution。在生物體內(nèi), 不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能, 通過Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫[14]。

1.4 qRT-PCR轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證

隨機(jī)選取8個差異性表達(dá)的基因進(jìn)行qRT-PCR分析, 對高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。分別提取對照組(CK)與干旱組(D)的葉片RNA, 采用HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn), Actin基因作為內(nèi)參。各個處理均做3次重復(fù), 計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 干旱脅迫條件下草地早熟禾8個差異性表達(dá)基因qRT-PCR引物Table 1 Primers of eight differentially expressed genes used for quantitative real-time PCR in P. pratensis at drought stress

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評估

測序得到的原始測序序列Raw Reads中含有帶接頭的、低質(zhì)量的Reads, 對照及各處理組的Raw Reads都在4052萬條以上。在去除帶接頭的Reads、去除N的比例大于0.1%的Reads、去除低質(zhì)量Reads (質(zhì)量值Qphred≤20的堿基數(shù)占整個Reads的50%以上的Reads) 后, 得到Clean Reads, 后續(xù)分析都基于Clean Reads。經(jīng)過濾后, 共得到59.35G的有效Reads (Clean Reads)。由表2可知, 各組得到的Clean Reads的量占原始Reads的比例都達(dá)到了96%以上, 說明測序的建庫工作質(zhì)量良好。

表2 測序數(shù)據(jù)輸出質(zhì)量情況Table 2 Sequencing data quality evaluation

2.2 轉(zhuǎn)錄組的拼接

拼接所得的序列長度用于衡量拼接質(zhì)量, 如拼接所得的序列長度越長, 則測序質(zhì)量越好。經(jīng)Trinity拼接后, 獲得轉(zhuǎn)錄本(Transcript)435250條, 總長度為324271434 nt,平均長度為745 nt, N50長度為1163 bp；Unigene 254331條, 總長度為147657025 nt,平均長度為581 nt, N50長度為818 bp。具體的組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3數(shù)據(jù)可知, 拼接所得片段有很高的組裝完整性, 拼接所得序列長, 測序質(zhì)量好。

2.3 基因功能注釋

為了預(yù)測Unigene的功能, 對其進(jìn)行基因注釋, 具體方法為將Unigene序列分別與主要的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫, 如GO、KEGG、NR等進(jìn)行基因信息比對, 最終有254331條Unigene獲得注釋, 其中, NR數(shù)據(jù)庫注釋的信息最多, 占全部Unigene的30.58%。7842條Unigene同時比對到7個數(shù)據(jù)庫中, 占總數(shù)的3.08%。105852條Unigene至少在一個數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋, 占到總數(shù)的41.61%。結(jié)果如圖1所示。

表3 Unigene與轉(zhuǎn)錄本的長度統(tǒng)計(jì)結(jié)果表Table 3 Unigene and transcript length statistics

N50: 將組裝片段按從長到短排序, 并進(jìn)行長度值累加, 當(dāng)長度值累計(jì)至總長度的50%時, 最后累加的片段長度值。Unigene: 取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為該基因的代表, 稱為Unigene, 以此進(jìn)行后續(xù)的分析。nt: 核苷酸單位。N50: The assembled segments are sorted from long to short and the length values are accumulated. When the length value is accumulated to 50% of the total length. The last accumulated fragment length value. Unigene: The longest transcript of each gene was used as a representative of the gene, called Unigene, followed by subsequent analysis. nt: The unit of nucleotides.

2.4 基因差異性表達(dá)分析

圖1 Unigene在各大數(shù)據(jù)庫中的功能注釋分布柱狀圖Fig.1 Distribution histogram of Unigene functional annotation according to the major databases

對對照組(CK)與干旱組(D)進(jìn)行差異基因篩選(DEGs), 經(jīng)篩選, 共鑒定出24465個差異表達(dá)的基因, 其中上調(diào)基因有12783個, 占差異表達(dá)基因總數(shù)的52.25%；下調(diào)基因共11682個, 占差異表達(dá)基因總數(shù)的47.75%。結(jié)果如圖2所示。

2.5 差異表達(dá)基因的GO分析

GO 分析(gene ontology)是一個常用的基因功能分類體系, 它按照生物途徑(biology process), 分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)對基因進(jìn)行注釋和分類。通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO terms富集度統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析, 計(jì)算出差異基因GO term的p-value和p-value的FDR值(q-value), 定位差異基因最可能相關(guān)的GO term。GO 分析對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有提示的作用, 通過差異基因的GO 分析, 可以找到富集差異基因的GO分類條目, 尋找不同樣品的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關(guān)。

圖2 干旱處理(D)/對照組(CK)基因差異表達(dá)分析火山圖Fig.2 Volcanic map of differential gene expression analysis between drought treatment (D)/control group (CK)

對干旱組(D)與對照組(CK)之間的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO功能分析得到圖3, 經(jīng)分析, 代謝過程(metabolic process)、蛋白磷酸化(protein phosphorylation)、泛素連接酶復(fù)合物(ubiquitin ligase complex)、催化活性(catalytic activity)和蛋白激酶活性(protein kinase activity)等與干旱脅迫緊密相關(guān)的生物學(xué)途徑、分子功能、細(xì)胞組成等都有明顯的響應(yīng)變化。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集分類Fig.3 GO enrichment classification of differentially expressed genes 1: 響應(yīng)水 Response to water；2: 大分子修飾 Macromolecule modification；3: 蛋白磷酸化 Protein phosphorylation；4: 細(xì)胞蛋白修飾過程 Cellular protein modification proess；5: 蛋白修飾過程 Protein modification process；6: 響應(yīng)非生物刺激 Response to abiotic stimulus；7: 響應(yīng)無機(jī)物質(zhì) Response to inorganic substance；8: 蛋白代謝過程 Protein metabolic process；9: 響應(yīng)含氧化合物 Response to oxygen-containing compound；10: 磷酸化 Phosphorylation；11: 響應(yīng)酸性化學(xué)品 Response to acid chemical；12: 代謝過程 Metabolic process；13: 細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程 Cellular protein metabolic process；14: 磷酸代謝過程 Phosphorus metabolic process；15: 含磷酸鹽的化合物代謝 Phosphate-containing compound metabolic；16: 蛋白泛素化 Protein ubiquitination；17: 小蛋白質(zhì)共軛修飾 Protein modification by small protein conjugation；18: 小蛋白質(zhì)共軛或去除修飾 Protein modification by small protein conjugation or removal；19: 過期過氧化酶反應(yīng) Obsolete peroxidase reaction；20: 脂質(zhì)生物合成過程 Lipid biosynthesis process；21: 泛素連接酶復(fù)合物 Ubiquitin ligase complex；22: Cullin-RING泛素連接酶復(fù)合物 Cullin-RING ubiquitin ligase complex；23: 核泛素連接酶復(fù)合物 Nuclear ubiquitin ligase complex；24: 后期促進(jìn)復(fù)合物 Anaphase-promoting complex；25: 脂肪酸合酶復(fù)合物 Fatty acid synthase complex；26: 光系統(tǒng)Ⅱ氧氣演變復(fù)合體 Photosystem Ⅱ oxygen evolving complex；27: 轉(zhuǎn)移酶活性 Transferase activity；28: 催化活性 Catalytic activity；29: 蛋白激酶活性 Protein kinase activity；30: 磷酸轉(zhuǎn)移酶活性, 酒精組作為受體 Phosphotransferase activity, alcohol group as acceptor；31: 激酶活性 Kinase activity；32: 泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性 Ubiquitin-protein transferase activity；33: 泛素類似蛋白轉(zhuǎn)移酶活性 Ubiquitin-like protein transferase activity；34: 血紅素結(jié)合 Heme binding；35: 四吡咯結(jié)合 Tetrapyrrole binding；36: 轉(zhuǎn)移酶活性, 轉(zhuǎn)移含磷基因 Transferase activity, transferring phosphorus-containing groups；37: ATP結(jié)合 ATP binding；38: 轉(zhuǎn)移酶活性, 轉(zhuǎn)移除氨基酰基以外的?；?Transferase activity, transferring acyl groups other than amino-acyl groups；39: 嘌呤核糖核苷三磷酸結(jié)合 Purine ribonucleoside triphosphate binding；40: 脂肪酸合酶活性 Fatty acid synthase activity；41: 轉(zhuǎn)移酶活性, 轉(zhuǎn)移己糖基 Transferase activity, transferring hexosyl groups；42: 離子結(jié)合 Ion binding；43: 3-氧代?；?[?；?載體-蛋白]合酶活性 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase activity；44: 腺苷酸核糖核酸結(jié)合 Adenyl ribonucleotide binding；45: 過氧化物酶活性 Peroxidase activity；46: 腺苷酸核苷酸結(jié)合 Adenyl nucleotide binding.

其中, 4143個上調(diào)Unigenes, 有2416個(58%)Unigenes注釋到生物學(xué)過程(BP), 其中富集較顯著的分布在蛋白質(zhì)改性過程(protein modification process)與單生物體運(yùn)輸(single-organism transport)；543個(13%)Unigenes注釋到細(xì)胞組分(CC), 其中富集較顯著的為nucleus；1181個(29%)Unigenes注釋到分子功能(MF), 其中富集較顯著的為轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity)和陽離子活性(cation activity)。

4415個下調(diào)Unigene, 有2643個(60%)Unigenes注釋到生物過程(BP), 其中富集最顯著的為代謝過程(metabolic process)和大分子代謝過程(macromolecule metabolic process);550個(12%)Unigenes注釋到細(xì)胞組分(CC), 1217個(28%)Unigenes注釋到分子功能(MF), 均勻分布在20類基因功能中。

2.6 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫, 可用于進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析與代謝網(wǎng)絡(luò)研究。為對樣本進(jìn)行全面的代謝通路分析, 將測序所得Unigene序列比對到KEGG數(shù)據(jù)庫。不同數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 共有20398條Unigenes在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到注釋, 占總數(shù)的8.02%, 參與到129個代謝途徑中, 其中注釋到植物-病原體相互作用(plant-pathogen interaction)中的最多, 為848個。

對樣本對照組(CK)與干旱組(D)之間的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行KEGG代謝通路分析后, 共獲得差異表達(dá)基因(DEGs)8764個, 對應(yīng)在307個代謝通路中。

表4 草地早熟禾干旱脅迫下差異基因富集程度排名前20的Pathway條目Table 4 Top 20 enrichment pathway in responses to drought in Poa pratensis

圖4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn), 在307個KEGG Pathway中最顯著的4個Pathway的是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、光合作用蛋白(photosynthesis-antenna proteins)、光合作用(photosynthesis)以及半乳糖代謝(galactose metabolism)。 由表4和圖4可知, 排名前20顯著性富集差異基因占差異表達(dá)基因總量的13.77%, 主要涉及代謝途徑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及次生代謝等。其中, 與碳代謝相關(guān)的基因占差異表達(dá)基因總量的2.20%, 與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因占1.73%, 淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的基因占1.52%, 糖酵解相關(guān)的基因占1.16%, 其他相關(guān)基因所占比例相對較低。差異性表達(dá)基因在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和碳代謝的通道上富集程度較高。

從植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、光合作用蛋白(photosynthesis-antenna proteins)、果糖和甘露糖代謝(fructose and mannose metabolism)等Pathway中候選出部分與吲哚-3-甘油磷酸合成酶、蛋白磷酸酶、己糖激酶、鈣結(jié)合蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白有關(guān)的基因作為草地早熟禾干旱響應(yīng)的候選基因。主要有c120656_g1、c122301_g3、c145664_g1、c117236_g1 、c119413_g2、c137695_g1、c123772_g1、c135567_g1等。

2.7 差異表達(dá)基因的qPT-PCR熒光定量驗(yàn)證

隨機(jī)選取8個差異表達(dá)基因, 其中含有4個上調(diào)表達(dá)的差異基因(c111268_g1、c145664_g1、c145507_g1、c128115_g1)和4個下調(diào)表達(dá)的差異基因(c117236_g1、c119413_g2、c135104_g1、c93924_g1), 以Actin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。由圖5可知, 8個基因在干旱脅迫下的表達(dá)程度不同, 但表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果基本一致, 即表明測序結(jié)果真實(shí)可靠。

圖5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.5 Validation of DEGs data by qRT-PCR

3 討論

植物在干旱脅迫下, 細(xì)胞感受干旱脅迫信號, 通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)和生理反應(yīng), 同時從轉(zhuǎn)錄和翻譯等不同水平做出響應(yīng)。目前, 草地早熟禾尚未完成基因組測序, 沒有完整的基因組序列可供參考, 因而不依賴基因組序列信息的高通量測序成為研究草地早熟禾干旱響應(yīng)基因差異表達(dá)更好的選擇。通過數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)評估可知數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。

在GO功能分析中, 生物學(xué)過程的差異表達(dá)基因差異在蛋白磷酸化、蛋白質(zhì)修飾過程、磷代謝過程等；細(xì)胞組分顯著差異在泛素連接酶復(fù)合物、后期促進(jìn)復(fù)合物、細(xì)胞膜等；分子功能顯著差異在轉(zhuǎn)移酶、蛋白激酶、過氧化物酶、脂肪酸合酶等。這說明草地早熟禾干旱脅迫響應(yīng)是一個復(fù)雜的生理變化過程, 要提高其抗旱性也不是單個基因可以完成的。許多研究表明, Ca2+參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。當(dāng)植物受到脅迫時, 細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度瞬時增加, 細(xì)胞質(zhì)Ca2+可以與各種鈣結(jié)合蛋白相互作用, 發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。目前, 人們在植物中鑒定出鈣調(diào)素、CDPKs(蛋白激酶)和CBLs(鈣調(diào)磷酸酶類蛋白)這三類Ca2+感受體參與了脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[15-16]。有研究顯示, 玉米絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2Ca與玉米對干旱脅迫的應(yīng)答有關(guān)[17]；紫花苜蓿促分裂原活化蛋白激酶MAPK基因與抗旱相關(guān), 其中MMK4可能作為信號傳遞體參與磷酸化與去磷酸化的過程, 來調(diào)控紫花苜蓿對干旱的適應(yīng)性反應(yīng)[18]；水稻OsDISI基因通過在轉(zhuǎn)錄水平上抑制一系列干旱正調(diào)控因子和誘導(dǎo)一系列干旱負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)而負(fù)調(diào)控水稻的干旱脅迫響應(yīng)過程[19]。本研究發(fā)現(xiàn)草地早熟禾干旱脅迫中蛋白激酶活性(GO: 0004672)上調(diào)基因394個與蛋白磷酸酶活性(GO: 0004721)上調(diào)基因14個都參與了草地早熟禾對干旱脅迫的響應(yīng)。

在干旱脅迫下, 植物會產(chǎn)生內(nèi)源激素來提高植物水分的利用效率。在這些激素中, 以ABA的研究最為廣泛。ABA作為信號分子, 通過活化保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上的PLC和Ca2+離子內(nèi)流通道, 引起保衛(wèi)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的升高, 并激活K+外流通道, 最終使保衛(wèi)細(xì)胞水勢升高而失水, 引起氣孔關(guān)閉, 抑制蒸騰作用, 從而增強(qiáng)植物對干旱的防御性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn), 在植物體中許多基因的表達(dá)受干旱脅迫調(diào)控, 其中相當(dāng)一部分基因響應(yīng)ABA[20]。另外, 在對野生小麥根干旱響應(yīng)蛋白的篩選與鑒定中發(fā)現(xiàn), 表達(dá)差異蛋白主要涉及碳代謝等[21]。本研究中, 通過對草地早熟禾差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn), 在前20顯著性富集差異中, 與碳代謝(ko01200)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)相關(guān)的基因相對較多。

在對擬南芥的耐受脅迫的研究中發(fā)現(xiàn), 由茉莉酮酸介導(dǎo)的代謝途徑的協(xié)調(diào)激活提供了對環(huán)境脅迫的抵抗力, 這些代謝途徑中包含有吲哚-3-甘油磷酸合成酶的基因[22]。大麥穗干旱脅迫下發(fā)現(xiàn), 它的芒中吲哚-3-甘油磷酸合成酶和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因下調(diào)表達(dá)[23]。在擬南芥中, 葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCB)基因的下調(diào)表達(dá)會降低氣孔運(yùn)動對ABA的反應(yīng)度, 從而導(dǎo)致擬南芥在干旱脅迫下的耐受性降低, 反之則增強(qiáng)[24]。在黑麥草的干旱脅迫研究中發(fā)現(xiàn), 碳代謝相關(guān)基因有助于提高耐旱性, 其中己糖激酶(HxK)編碼基因在抗性系中顯示上調(diào)[25]。

使用qRT-PCR對隨機(jī)選出的8個基因的表達(dá)量檢測結(jié)果與高通量測序的表達(dá)結(jié)果總體趨勢吻合, 但在具體表達(dá)倍數(shù)的數(shù)值上存在差異, 這可能與樣本送測時間, 數(shù)據(jù)分析方法及檢測靈敏度不同有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究以草地早熟禾‘Nuglade’為材料, 以正常水分和干旱脅迫條件下的2個樣本葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析, 在轉(zhuǎn)錄水平上獲得254331個基因的真實(shí)序列信息。檢出17110個SSR位點(diǎn), 通過差異基因篩選, 共鑒定出24465個差異表達(dá)基因。其中有12783個DGEs在干旱脅迫響應(yīng)中表達(dá)上調(diào), 11682個表達(dá)下調(diào)。分析得出, 與蛋白激酶、蛋白磷酸酶、碳代謝以及ABA等相關(guān)的基因可以作為研究草地早熟禾干旱響應(yīng)機(jī)制的主要研究對象, 吲哚-3-甘油磷酸合成酶、蛋白磷酸酶、己糖激酶、鈣結(jié)合蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因或轉(zhuǎn)錄因子可作為與草地早熟禾干旱脅迫相關(guān)的應(yīng)答候選基因, 從而揭示草地早熟禾葉片響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制。

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DifferentialgeneanalysisofPoapratensisinresponsetodroughtstress

LENG Nuan1, LIU Xiao-Wei2, ZHANG Na1, XU Li-Xin1*

1.InstituteofTurfgrassScience,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.NanjingOldMountainForestFarm,Nanjing211811,China

Drought is one of the main factors affecting the productivity ofPoapratensis. This study was undertaken to reveal the change of gene expression profile ofP.pratensisin the absence of a reference genome. The high-throughput Illumina Hiseq sequencing platform was used to investigate the transcriptome of a control group (CK) and a drought treated group (D) ofP.pratensis. The sequencing data were subsequently analyzed to help reveal the molecular mechanisms of drought response inP.pratensis. The results showed that 24465 differentially expressed genes were detected under drought treatment. After screening 4143 up-regulated genes and 4415 down-regulated genes were obtained, accounting for 34.98% of the total number of differentially expressed genes. The genes related to protein kinase, protein phosphatase, carbon metabolism and ABA can be used as the main research object to study the drought response mechanism ofP.pratensis. qRT-PCR analysis showed that the expression of 8 randomly differentially expressed genes was consistent with the high-throughput sequencing results. In addition, a series of genes for indole-3-glycerophosphate synthase, protein phosphatase, carbohydrate kinase, calcium binding protein and chlorophyll a/b binding protein were selected as candidate genes for drought stress related toP.pratensis. This laid the foundation for potentially revealing the molecular mechanism of drought response inP.pratensis.

Poapratensis; drought stress; high-throughput sequencing; transcription group

10.11686/cyxb2017130http//cyxb.lzu.edu.cn

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2017-03-21；改回日期：2017-06-14

中國林學(xué)會——青年人才托舉工程項(xiàng)目資助。

冷暖(1992-)，女，山東威海人，在讀碩士。E-mail:lengnuan99@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail：lixinxu@bjfu.edu.cn