史瑞婕，郭豐銘，馮翠萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)*

史瑞婕，郭豐銘，馮翠萍**

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

為提高杏鮑菇（Pleurotus eryngii）蛋白質(zhì)的提取率，本試驗(yàn)采用纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法進(jìn)行提取，以料液比、酶的添加量、反應(yīng)時間和溫度為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶解條件，與單一堿提酸沉法提取蛋白質(zhì)后的提取率進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，纖維素酶解最佳工藝條件為：料液比1:55，溫度40℃，時間100 min，酶的添加量1.5%，復(fù)合堿提酸沉后蛋白質(zhì)提取率為51.36%，顯著高于堿提酸沉法的45.89%。因此，纖維素酶復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)優(yōu)于堿提酸沉法。

杏鮑菇；蛋白質(zhì)；酶解復(fù)合堿提酸沉法；堿提酸沉法

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），又稱刺芹木耳，隸屬于真菌門（Eumycota） 真擔(dān)子菌綱（Eubasidiomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 側(cè)耳屬 （Pleurotus），有“菇中之王”的美稱，是藥食同源的珍稀食用菌[1-4]。杏鮑菇富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素和多種礦物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量為12.4%～35%[5-8]，具有抗氧化和免疫活性調(diào)節(jié)等功能[9]，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源的食物。目前，蛋白質(zhì)的提取工藝有傳統(tǒng)的堿

提酸沉法[10-11]、鹽溶法等[12-13]，本課題組前期研究表明，堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率可達(dá)45%左右[14]。對于杏鮑菇而言，其菌體細(xì)胞壁含有大量的纖維素，可通過纖維素酶的作用來破壞細(xì)胞壁，從而達(dá)到釋放蛋白質(zhì)的目的，提高蛋白質(zhì)的提取率，因此本試驗(yàn)選擇纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，并進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期為杏鮑菇蛋白質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

杏鮑菇粉，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、無水乙醇、磷酸，均為國產(chǎn)分析純；纖維素酶，酶活力≥1.0×104U·g-1，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，上海哈靈生物科技有限公司；考馬斯亮蘭G-250染料試劑，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

HHS-21-4型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TDL-4臺式離心機(jī)，湘儀離心機(jī)廠；PHS-3C型精密pH計，上海虹益儀器儀表有限公司；BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；JDG-0.2型冷凍干燥機(jī)，蘭州科技真空凍干技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；UV-2102C型紫外/可見分光光度計，上海美析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)

稱取一定量的杏鮑菇蛋白粉，按一定液料比加入蒸餾水，同時加入一定比例纖維素酶（以原料干粉計）并充分?jǐn)嚢?，在一定溫度下恒溫振蕩反?yīng)一定時間，結(jié)束后在80℃水浴中進(jìn)行鈍化酶處理。放置常溫后，調(diào)節(jié)pH到12，55℃反應(yīng)2.5 h，之后在4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，沉淀重復(fù)上述操作進(jìn)行復(fù)提，合并2次上清液。用0.1 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH到杏鮑菇蛋白質(zhì)等電點(diǎn)3.6，靜止1 h，在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到蛋白質(zhì)沉淀，加蒸餾水溶解，用0.01 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，得到杏鮑菇蛋白質(zhì)提取液，測定總蛋白含量，濃縮后進(jìn)行透析除鹽，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到杏鮑菇蛋白粉。

1.2.2 纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法最佳工藝條件的確定

（1）不同酶解條件對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響

料液比：在酶添加量2.0%，作用時間90 min，溫度 40℃的條件下，設(shè)置料液比為 1∶40、1∶45、1∶50、1∶55和1∶60，之后進(jìn)行鈍化酶處理，放置常溫后，再用堿提酸沉提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，考察料液比對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響。

酶添加量：在料液比1:55，酶作用時間90 min，溫度40℃的條件下，設(shè)置酶添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，之后進(jìn)行鈍化酶處理，放置常溫后，再用堿提酸沉提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，考察酶添加量對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響。

酶作用時間：在料液比1:55，酶添加量2.0%，溫度40℃的條件下，設(shè)置酶作用時間為60 min、90 min、120 min、150 min和180 min，之后進(jìn)行鈍化酶處理，放置常溫后，再用堿提酸沉提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，考察酶作用時間對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響。

溫度：在料液比1:55，酶添加量2.0%，酶作用時間90 min的條件下，設(shè)置溫度為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，之后進(jìn)行鈍化酶處理，放置常溫后，再用堿提酸沉提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，考察溫度對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，以杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出纖維素酶解杏鮑菇的最佳工藝條件。

1.2.3 堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]，稱取一定量的杏鮑菇粉，按料液比為1:55加入蒸餾水，并調(diào)節(jié)pH到12，于50℃條件下提取2.5 h。然后在4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，沉淀重復(fù)上述操作進(jìn)行復(fù)提，合并2次上清液。用0.1 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH到杏鮑菇蛋白質(zhì)等電點(diǎn)3.6，靜止1 h，在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到蛋白質(zhì)沉淀，加蒸餾水溶解，用0.01 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，得到杏鮑菇蛋白質(zhì)提取液，測定總蛋白含量，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到杏鮑菇蛋白粉。

1.2.4 蛋白質(zhì)的測定

（1） 試劑配制

考納斯亮藍(lán)G-250染液：稱取0.1 g的G-250粉末，溶解到50 mL質(zhì)量濃度為90%的乙醇中，同時加入100 mL質(zhì)量濃度為85%的磷酸，定容到1 L，得到G-250染液。

標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白7.5 mg，并溶于50 mL水中，混勻，配制成質(zhì)量濃度為0.15 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液，待用[15]。

（2） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確吸取配制好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于試管中，再分別加入水 1.0 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0，搖勻后，分別加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250染液，室溫下反應(yīng)2 min，在波長為595 nm的條件下測定其吸光度值A(chǔ)595，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出線性方程為：

式中：C為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g·L-1；A595為吸光度值；R2=0.9949。

（3）蛋白含量的測定

準(zhǔn)確吸取待測蛋白溶液1 mL于試管中，加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250染液，搖勻后，在室溫下反應(yīng)2 min，在1.2.4（1） 相同條件下測定其吸光度值A(chǔ)595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中蛋白含量（g）。

（4）蛋白質(zhì)提取率的計算

蛋白質(zhì)提取率（P）公式為：

式中：m1表示提取液中蛋白質(zhì)含量，g；m2表示杏鮑菇粉重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以 x±S表示，同時利用SPSS軟件進(jìn)行顯著分析，檢驗(yàn)水平α為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解條件對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響

不同酶解條件對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響見圖1。

圖1 不同酶解條件對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on the extraction ratio of Pleurotus eryngii protein

從圖1A中可知，隨著料液比的增大，蛋白質(zhì)的提取率呈先上升后下降的趨勢，這可能是因?yàn)榱弦罕容^低時，水分含量低時纖維素酶與底物反應(yīng)不充分，降低蛋白質(zhì)提取率，當(dāng)料液比增大時，水分含量增大到一定程度時使纖維素酶與底物結(jié)合不充分，導(dǎo)致催化作用率降低，蛋白質(zhì)提取率下降[16]；圖1B中表明了隨著溫度的提高，蛋白質(zhì)的提取率呈先升高后下降的趨勢，可能是因?yàn)榈蜏貢r有利于纖維素酶與底物的結(jié)合，使得催化作用加強(qiáng)，蛋白質(zhì)提取率增大，而高溫時，纖維素酶的活性降低，催化作用降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率增大；圖1C表明了隨著酶作用時間的延長，蛋白質(zhì)的提取率呈現(xiàn)升高后降低的趨勢，可能是由于在一定的反應(yīng)時間內(nèi)，纖維素酶與底物結(jié)合速率快，催化效率高，使得蛋白質(zhì)提取率增大，隨著反應(yīng)時間的延長，因?yàn)榈孜锪亢兔噶恳欢?，其結(jié)合速率下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率下降[17]；圖1D表明了隨著酶量的增加，蛋白質(zhì)提取率呈先增大后平衡的趨勢，可能是因?yàn)樵诘谝浑A段酶作用于底物速度快，使細(xì)胞內(nèi)容物盡快釋放出來，促使蛋白質(zhì)提取率增大，隨著酶量的增大，因?yàn)榇藭r底物量一定，酶量過多導(dǎo)致酶與底物結(jié)合率降低，從而使的蛋白質(zhì)提取率下降[18]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Tab.1 Experimental design and results of Box-Behnken

以料液比（A）、纖維素酶添加量（B）、反應(yīng)時間（C）、反應(yīng)溫度（D）為關(guān)鍵工藝參數(shù)，蛋白質(zhì)提取率（%）為指標(biāo)，根據(jù)表格1中的試驗(yàn)成果，運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行驗(yàn)證，同時并除去不顯著項，得出操作參數(shù)對提取率的回歸方程為：蛋白質(zhì)提取率（%）=59.94＋3.27×A＋5.14×B-0.054×C-2.53×D＋0.26×A×B＋0.83×A×C＋1.59×A×D-3.12×B×C-4.04×B×D-3.13×C×D-6.64×A2-3.07×B2-3.95×C2-6.36×D2。蛋白質(zhì)提取率多項式模型的方差分析見表2。

通過進(jìn)一步對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率回歸模型以及各項系數(shù)進(jìn)行方差顯著性分析，由表2可以得出，其 F=12.30，F(xiàn) （Prob＞F） ＜0.1000，得出杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的模型極顯著，且回歸方程的確定系數(shù)為R2=0.9513，表明了該模型的擬合程度比較好。該模型中單因素項A、B與D極顯著，C不顯著；交互作用BC、BD與CD極顯著；二次項A2、B2、C2與D2均極顯著。纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)響應(yīng)面分析見圖2。

圖2更加直觀地表明了BC、BD和CD之間交互作用對杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率的影響。圖2A表示在料液比和溫度一定時，隨著時間和酶量增加，蛋白質(zhì)提取率增大，當(dāng)時間大于150 min，酶量大于2.0%時，蛋白質(zhì)提取率幾乎不變；圖2B表明在料液比和時間一定時，隨著酶量和溫度的增大，蛋白質(zhì)提取率增大，加酶量大于2.0%，溫度大于45℃時，蛋白質(zhì)提取率降低；圖2C表明了料液比和酶量確定時，隨著溫度和時間增加，蛋白質(zhì)提取率增大，當(dāng)時間大于150 min，溫度高于45℃，蛋白質(zhì)提取率下降。

2.3 堿提酸沉法與纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法蛋白質(zhì)提取率比較

利用堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，所得的杏

鮑菇蛋白質(zhì)提取率為（45.89±0.21）%，利用纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法進(jìn)行提取，所得杏鮑菇蛋白質(zhì)提取率為（51.36±0.16） %，進(jìn)行顯著性分析后，得出在P＜0.05水平上存在顯著差異。

表2 蛋白質(zhì)提取率多項式模型的方差分析表Tab.2 Variance analysis table on polynomial model of protein extraction rate

圖2 纖維素酶解復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)響應(yīng)面Fig.2 Response surface plots showing the effects of interactions of Pleurotus eryngii protein

3 結(jié)論

纖維素酶解杏鮑菇的最佳工藝條件為：料液比1:55，溫度40℃，時間100 min，酶的添加量1.5%，在該工藝條件下復(fù)合堿提酸沉法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，其提取率達(dá)到51.36%，顯著高于單一堿提酸沉法的45.89%。

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Extracting Pleurotus eryngii Protein by Combining Cellulose Enzymatic Hydrolysis and Acid Precipitation After Alkaline Extraction

SHI Rui-jie,GUO Feng-ming,FENG Cui-ping
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agriculutural University,Taigu 030801,China)

To improve the extraction rate of Pleurotus eryngii protein,the method of combining cellulose enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction was used.The single factor test was carried out with the ratio of material to liquid,enzyme addition,reaction time and temperature as the factors,and Box-Behnken design was used to establish the optional hydrolysis conditions with the protein extraction rate as the response value.It was also compared with the extraction rate of alkaline extraction and acid precipitation.The results showed that the best extraction condition of cellulose enzymatic hydrolysis were as follows:material to liquid(m·v-1)1:55,enzyme addition 1.5%,reaction time 100 min and temperature 40℃.The extraction rate of combining cellulose enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction was 51.36%,which was significantly higher than that of acid precipitation after alkaline extraction.So extracting P.eryngii protein by combining cellulose enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction was better than the acid precipitation after alkaline extraction.

Pleurotus eryngii;protein;combining enzymatic hydrolysis and acid precipitation after alkaline extraction;alkaline extraction and acid precipitation

S646.1

A

1003-8310（2017）06-0058-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.013

山西省重點(diǎn)研發(fā)計劃（重點(diǎn)）項目（201603D211201）；山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項目（FT2014-03-01）；山西省黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心資助。

史瑞婕（1993-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail:srj0505＠163.com

**通信作者：馮翠萍（1970-），女，博士，教授，主要從事食品營養(yǎng)與安全。E-mail:ndfcp＠163.com

2017-09-22