顧張杰，傅澤茜，石 宇，梁 勇，史廣用，曲凱歌，王一東

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

抗羊肚菌菌絲特異性抗原單克隆抗體的制備與初步鑒定*

顧張杰，傅澤茜，石 宇，梁 勇，史廣用，曲凱歌，王一東**

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

為利用免疫學(xué)技術(shù)研究羊肚菌 [Morchella esculenta(L.)Pers.]菌絲生長發(fā)育規(guī)律，以菌株代號為51589的羊肚菌菌絲破碎液為抗原免疫Balb/c鼠，將致敏Balb/c鼠的B細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，經(jīng)鏡檢和ELISA間接法檢測，篩選出一分泌抗羊肚菌菌絲抗原單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為W2F3。經(jīng)傳代培養(yǎng)和亞克隆純化，得到穩(wěn)定分泌抗羊肚菌菌絲抗原單克隆抗體的細胞株，經(jīng)鑒定W2F3單克隆抗體抗體亞類為IgG1，輕鏈亞型為Kappa，初步確定該單抗對應(yīng)的抗原具有羊肚菌屬特異性。

羊肚菌；特異性抗原；單克隆抗體

羊肚菌 [Morchella esculenta(L.)Pers.]屬子囊菌亞門 （Ascomycotina） 盤菌綱 （Pezizomycetes） 盤菌目（Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌屬（Morchella），是1種珍稀食（藥） 用菌，味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)和保健價值[1-4]。由于人們對它的生活史了解不完整，目前還無法實現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模人工栽培，價格居高不下，因此對羊肚菌菌絲發(fā)育、子實體形成等生活史的研究具有重要的經(jīng)濟和理論研究價值[5]。免疫學(xué)技術(shù)尤其是單克隆抗體技術(shù)在對特異性抗原的定位、跟蹤、檢測等方面的研究具有得天獨厚的優(yōu)勢[6-7]，本研究即利用經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)制備抗羊肚菌菌絲特異性抗原單克隆抗體，并對制備的單克隆抗體進行初步鑒定?？寡蚨蔷鷨慰寺】贵w尤其是識別羊肚菌特殊生命階段的標識性抗原的單克隆抗體的制備，將為人們認識、了解羊肚菌一些特殊生命現(xiàn)象發(fā)生條件與規(guī)律提供技術(shù)方法支持，進而為了解羊肚菌的生活史，實現(xiàn)羊肚菌的人工栽培提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種、細胞株與實驗動物

羊肚菌（Morchella esculenta） 51589，寬圓羊肚菌（M.rotunda） 50759，購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

2B2和2G9，本實驗室分離得到的羊肚菌單孢子菌株[8]。

羊肚菌子實體1，于2015年5月采于吉林省四平市伊通滿族自治縣；羊肚菌子實體2，2016年5月采于吉林省長春市凈月潭國家森林公園。

金針菇（Flammulina velutipes）、黑木耳（Auricularia auricula），購于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所。

Balb/c鼠骨髓瘤細胞株SP2/0，吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部惠贈。

Balb/c鼠，雌性，8周～10周齡，購于北京華阜康生物公司。

1.1.2 試劑

RPMI Medium 1640，Invitrogen Corporation公司產(chǎn)品；小牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；PEG（分子量4 000），北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司分裝；HAT、HT、TMB，Sigma公司產(chǎn)品；HRP標記山羊抗鼠IgG(H＋L)，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定試劑盒，購于洛陽佰奧通實驗材料中心；其他試劑為國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；XD30倒置顯微鏡，寧波舜宇公司；Galaxy 170S CO2培養(yǎng)箱，Eppendorf公司產(chǎn)品；HZQ-QX全溫振蕩器，東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；ELx80TM酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊肚菌菌絲抗原液的制備與Balb/c鼠免疫

根據(jù)前期的工作經(jīng)驗[9-10]，操作如下。

（1）羊肚菌菌絲抗原液制備

無菌挑取適量標準羊肚菌菌種（51 589株）接種于無菌的含125 mLPDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，將三角瓶瓶置于溫度為22℃、轉(zhuǎn)速為110 r·min-1的恒溫震蕩器中培養(yǎng)。3 d后收集培養(yǎng)得到的菌絲（球）用蒸餾水洗滌離心3次后進行冷凍，置凍干機中凍干至恒重。稱取0.74 g的凍干菌絲置于研缽中，加入適量無菌海砂研磨15 min，加入適量磷酸鹽緩沖液（pH7.4，以下簡稱PBS），收集研磨混合物于離心管中，3 000 r·min-1離心20 min，取上清液10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液4.9 mL，該上清液即為羊肚菌菌絲標準抗原液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2） 免疫

用制備的羊肚菌菌絲抗原溶液對4只8周～10周齡的雌性Balb/c鼠進行腹腔注射0.5 mL，共免疫3次，每次間隔1周。第3次免疫1周后，斷尾取血檢測血清效價，以檢測免疫效果。準備取脾制備B細胞懸液。

1.2.2 細胞融合與雜交瘤細胞的篩選

（1）細胞培養(yǎng)液的準備

不完全1640培養(yǎng)液、小牛血清、雙抗、HAT培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液按文獻 [11]處理，無菌環(huán)境下經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝后4℃或-20℃保存。雙抗的工作濃度為青霉素100 U·mL-1、硫酸鏈霉素100 μg·mL-1。完全1640培養(yǎng)液為含有10%小牛血清的不完全1640培養(yǎng)液（含雙抗）。

（2） 細胞融合

參照文獻 [11-12]進行如下操作。

飼養(yǎng)細胞準備：取1只小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5 min后，于超凈工作臺中無菌操作制備小鼠腹腔細胞懸液，按2×104個/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，飼養(yǎng)細胞應(yīng)在融合前的1 d～2 d準備。

脾細胞準備：取免疫后的Balb/c鼠，眼球放血（收集分離血清做抗體陽性樣本），頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5 min后在超凈工作臺內(nèi)無菌取脾，研磨，制備脾細胞懸液，計數(shù)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中備用。

細胞融合：將作為細胞融合劑的50%PEG溶液（青霉素瓶中加入1 gPEG粉與1 mL不完全1640培養(yǎng)液，密閉封裝，121℃高壓蒸汽滅菌20 min）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中備用。將提前準備好的脾細胞（8.7×107個） 與在HAT選擇性培養(yǎng)基中不能生長且處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞SP2/0（1.0×107個）于15 mL離心管中混合，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清。37℃水浴中滴加PEG溶液，每3秒滴加1滴，共20滴（約1 mL）。靜置90 s，然后5 min內(nèi)加入10 mL37℃預(yù)熱的不完全1640培養(yǎng)液（第1分鐘加1 mL，第2分鐘加4 mL，剩余液體 min內(nèi)加完）。1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。向離心管中加入10 mL37℃預(yù)熱的不完全1640培養(yǎng)液并輕輕懸浮細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。將得到的細胞溶于20 mL37℃預(yù)熱的HAT培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞使其懸浮后，以每孔約100 μL（2滴） 加入含飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（3）雜交瘤細胞的篩選

ELISA間接法的建立，具體操作如下。

包被：51589菌絲破碎液（制備方法同1.2.1（1）），用pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液適當稀釋，每孔100 μL包被酶標板，4℃過夜。用含有0.05%吐溫20的PBS洗滌液洗滌3次，每次3 min，甩干（此過程以下簡稱洗滌），4℃?zhèn)溆谩?/p>

一抗：待測雜交瘤細胞上清，100倍稀釋的陽性血清為陽性對照，沒有克隆細胞團的孔中的培養(yǎng)液上清為陰性對照，每孔100 μL，37℃溫育1 h后洗滌。

二抗：HRP標記山羊抗鼠IgG(H＋L)，濃度為1:5 000，每孔100 μL，37℃溫育1 h后洗滌。

顯色：按底物緩沖液∶TMB∶H2O2=2 000∶20∶3 配成顯色液，每孔100 μL，顯色15 min。

終止顯色：每孔加入 50 μL2 mol·L-1的 H2SO4終止反應(yīng)。

結(jié)果：用酶標儀檢測各孔OD值，并記錄分析。

雜交瘤細胞的篩選：融合7 d后開始鏡檢，仔細觀察每一個細胞培養(yǎng)板孔，發(fā)現(xiàn)并記錄（可在孔板上用記號筆做標記）每個雜交瘤細胞團，當細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)雜交瘤細胞團長到約占整個孔底的1/3時，每孔無菌吸取100 μL上清進行ELISA間接法檢測，并向吸取上清后的孔中每孔補加100 μLHAT培養(yǎng)液。根據(jù)細胞的生長情況，第1次檢測3 d～5 d后，同樣方法再檢測1次，并補加HT培養(yǎng)液。選取檢測結(jié)果中陽性最高的孔，將孔中的雜交瘤細胞轉(zhuǎn)移擴大培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液由HT培養(yǎng)液逐漸過渡到完全1640培養(yǎng)液。

1.2.3 雜交瘤細胞亞克隆與抗體的制備

由于雜交瘤細胞團中可能存在不分泌抗體的瘤細胞，所以應(yīng)該盡早進行亞克隆操作。亞克隆操作步驟如下。

飼養(yǎng)細胞準備，方法同1.2.2（2）中的飼養(yǎng)細胞準備。

取待亞克隆的雜交瘤細胞加入15 mL離心管中，加完全1640培養(yǎng)液至10 mL，1 500 r·min-1離心5 min，倒掉上清再加完全1640培養(yǎng)液，將細胞懸液稀釋到10個·mL-1（每板需10 mL，共100個細胞），100 μL·孔-1加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，將細胞培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

7 d后觀察到細胞培養(yǎng)板中出現(xiàn)小雜交瘤細胞團，標記，待雜交瘤細胞團長到占整個孔底的1/3時，無菌抽取被標記的孔中的上清進行ELISA檢測，每孔抽取100 μL并同時補加完全1640培養(yǎng)液。將陽性孔中的雜交瘤細胞轉(zhuǎn)移擴大培養(yǎng)。

經(jīng)過數(shù)次傳代培養(yǎng)和2次亞克隆操作，獲得比較穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，收集該雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，該上清液即為含有單克隆抗體的溶液。細胞株進行超低溫凍存。

1.2.4 抗體亞型鑒定

取亞克隆后的雜交瘤細胞的上清，依照說明書用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對其進行鑒定。

1.2.5 抗體特異性檢測

（1） 包被

制備方法同1.2.2（3），將51589菌絲破碎液、50759菌絲破碎液、2B2菌絲破碎液、2G9菌絲破碎液、羊肚菌子實體1破碎液、羊肚菌子實體2破碎液、金針菇菌絲破碎液、黑木耳菌絲破碎液，用包被緩沖液稀釋，以包被緩沖液作為空白對照。100 μL·孔-1，4℃過夜，洗滌。

（2） 一抗

8倍稀釋的W2F3細胞上清液，每孔100 μL，37℃溫育1 h，洗滌。剩余步驟參照1.2.2（3） 中ELISA間接法的建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞融合結(jié)果

進行6次細胞融合（平行試驗），共1 536個細胞培養(yǎng)孔，其中358個孔中有雜交瘤細胞團，242個孔中為單克隆細胞團。部分單克隆孔中的上清進行ELISA檢測，結(jié)果見表 1。表 1中 1B11、1D9、1E10等代表細胞培養(yǎng)板孔的標號，“＋”孔中加入的100倍稀釋陽性血清，作為陽性對照，“-”孔中加入的沒有克隆細胞團孔中的培養(yǎng)液上清，作為陰性對照。

由表1可知，以P/N≥2.1為判定標準，2F3中的單克隆細胞團為陽性（命名為W2F3），1D9和6C4中的單克隆細胞團有陽性的趨勢。

表1 部分含單克隆細胞團孔中上清的ELISA檢測結(jié)果Tab.1 ELISA results of supernatant of monoclonal cell pellets

2.2 抗體亞型鑒定結(jié)果

依照鼠單抗亞型鑒定ELISA試劑盒說明書對W2F3進行鑒定，結(jié)果表明，W2F3抗體亞類為IgG1，輕鏈亞型為Kappa。

2.3 抗體特異性檢測結(jié)果

利用ELISA間接法對雜交瘤細胞W2F3的上清液進行檢測，以P/N≥2.1判定為陽性，結(jié)果見表2。

表2 單克隆抗體W2F3特異性檢測結(jié)果Tab.2 Results of specific detection of monoclonal antibody W2F3

由表 2可知，W2F3與 51589、50759、2B2、2G9、羊肚菌子實體ELISA檢測均顯陽性反應(yīng)，與金針菇、黑木耳均無交叉，說明W2F3所對應(yīng)的抗原是羊肚菌的特異性抗原。

3 討論

理論上可以通過單克隆抗體技術(shù)對羊肚菌生活史中所有階段菌絲的所有抗原進行精確的識別與定位。實際工作中可以通過篩選羊肚菌生活史中不同階段有代表性的標識性抗原，并制備相對應(yīng)的單抗建立檢測方法，進而去發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌絲的發(fā)育變化條件與規(guī)律及羊肚菌的生活史。在標識性抗原的篩選上，可以通過分子生物學(xué)、生化分離技術(shù)方法純化羊肚菌標識性抗原，可以較容易地制備只針對單一抗原、親和力更強的抗羊肚菌菌絲特異性抗原單克隆抗體；或者用雜抗原免疫，通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)、噬菌體庫展示技術(shù)等手段調(diào)取所需抗原的單克隆抗體。

在本實驗研究中我們利用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)，以雜抗原免疫小鼠，篩選出1株抗羊肚菌菌絲特異性抗原的單克隆抗體雜交瘤細胞株W2F3，對其進行初步鑒定。W2F3單抗對應(yīng)抗原的結(jié)構(gòu)與功能及其在菌絲細胞的分布等，還有待進一步的研究確定。本研究說明用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備抗羊肚菌單克隆抗體是可行的，這為制備識別羊肚菌菌絲不同生長階段中標識性抗原的單抗提供了1種可行的方法參考。

通過收集雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液或?qū)㈦s交瘤細胞接種到Balb/c鼠腹腔內(nèi)收集腹水以獲得單克隆抗體，本研究使用的W2F3單抗是W2F3雜交瘤細胞株的培養(yǎng)液上清。初步的特異性檢測結(jié)果顯示該單抗對應(yīng)的抗原具有羊肚菌屬特異性，可以在此基礎(chǔ)上進行更廣范圍的菌屬特異性檢測試驗，如果滿足菌屬特異性條件的話，該單抗可以作為菌屬和菌種的鑒定使用。

經(jīng)過2次亞克隆操作和30余代的傳代培養(yǎng)，對W2F3培養(yǎng)上清液進行亞型鑒定，結(jié)果為W2F3抗體亞類為IgG1，輕鏈亞型為Kappa，可以初步證明該抗體為單克隆抗體。在融合后鏡檢觀察96孔細胞培養(yǎng)板中的雜交瘤細胞的過程中，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)細胞中巨噬細胞吞噬雜交瘤細胞團造成雜交瘤丟失的現(xiàn)象，通過將飼養(yǎng)細胞的數(shù)量從2×104個/孔降到1×104個/孔，可有效降低吞噬現(xiàn)象的發(fā)生。

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Preparation and Preliminary Identification of Anti-Morchella Hyphae Specific Antigen Monoclonal Antibody

GU Zhang-jie,FU Ze-xi,SHI Yu,LIANG Yong,SHI Guang-yong,QU Kai-ge,WANG Yi-dong
（School of Life Science and Technology,Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022,China）

In order to study the growth and development of Morchella esculenta hyphae by immunological technology,Balb/c mice were immunized with the strain 51589 of M.esculenta hyphae,and B cells of sensitized Balb/c mice were fused with myeloma cells(SP2/0),screening out a monoclonal antibody against M.esculenta hyphae named W2F3 by microscopic examination and ELISA indirect detection.The monoclonal antibody against M.esculenta hyphae was obtained by subculturing and subcloning,and the subclass of W2F3 was identified as IgG1 and the light subtype was Kappa.It is tentatively determined that the antigen corresponding to the monoclonal antibody is specific to M.esculenta.

Morchella esculenta;specific antigen;monoclonal antibodies

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0064-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.014

吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項目（吉教科合字 [2016]第384號）；長春理工大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目”（2016G041）。

顧張杰（1997-），女，在讀本科生，主要研究方向為免疫學(xué)檢測。E-mail:1134551326＠qq.com

**通信作者：王一東（1962-），男，本科，高級實驗師，主要從事食品與衛(wèi)生檢驗研究。E-mail:wyd＠cust.edu.cn

2017-09-16