李金紅，霍 巖，付 莉，陶承光，史振聲

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧 沈陽 110161； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)特種玉米研究所，遼寧 沈陽110866； 3.錦州醫(yī)科大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

建立玉米幼胚高效再生體系的研究

李金紅1，2，霍 巖1，3，付 莉3，陶承光1，史振聲2

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧 沈陽 110161； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)特種玉米研究所，遼寧 沈陽110866； 3.錦州醫(yī)科大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

為建立高效的玉米再生體系，以玉米幼胚為材料，研究了不同濃度的L-Pro、AgNO3和2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，同時還分析了不同濃度的玉米素和IBA對分化和生根的影響，結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)率最佳的組合為基本培養(yǎng)基中添加 L-Pro 700 mg／L、AgNO30.1 mg／L和2、4-D 1.5 mg／L；在基本培養(yǎng)基中添加5 mg／L的玉米素可有效促進愈傷組織分化，再生芽和再生植株分化率分別達到97.96%和97.67%，在生根培養(yǎng)基中添加0.1 mg／L的IBA生根效果較好。

玉米；幼胚；愈傷誘導(dǎo)率；再生；

玉米是世界上重要的糧飼作物，我國經(jīng)濟發(fā)展和市場穩(wěn)定具有舉足輕重的作用［1，2］。利用分子生物學(xué)手段培育耐鹽堿玉米，對種植玉米面積的擴大和提高玉米產(chǎn)量具有重要意義［3～6］，而建立高效的再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化是否成功的的關(guān)鍵因子。因此玉米優(yōu)良基因型再生體系的建立一直是人們研究的熱點［7］。自1975年首次利用未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織獲得再生植株以來，玉米的再生體系技術(shù)獲得不斷發(fā)展［8］，如幼胚、成熟胚、胚芽鞘節(jié)、叢生芽等，但以玉米幼胚作為外植體，其誘導(dǎo)愈傷組織率和再生率都非常高［9～12］，然而其組織培養(yǎng)的過程中，影響因素頗為復(fù)雜。

本試驗設(shè)計了9種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對玉米A188自交系的進行誘導(dǎo)愈傷組織，并添加不同濃度的2、4-D和IBA對分化和生根進行誘導(dǎo)，并獲得再生植株，探索建立高效遺傳再生體系的條件，為建立高效的玉米轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為玉米自交系A(chǔ)188，2017年種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地，8月進行人工授粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼胚的獲得

在開花授粉期人工套袋，授粉后9～12 d，當幼胚長到1.0～1.2 mm大小時，取雌穗剝?nèi)グ~，每剝?nèi)ヒ粚影~噴灑75%的酒精，進行表面消毒，用刀片在超凈工作臺下挑去幼胚，盾片向上，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)培養(yǎng)基是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的2，4-D、硝酸銀（AgNO3）、脯氨酸（L-Pro），試驗設(shè)計見表1進行三因素三水平的正交試驗，每個處理接種100個幼胚，3次重復(fù)。7 d后及時切除胚根和胚芽，14 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率，確定最適宜配比濃度。

愈傷組織誘導(dǎo)率＝誘導(dǎo)出愈傷組織的幼胚數(shù)／接種總幼胚數(shù)×100%

1.2.3 玉米素的對幼苗分化的影響

將產(chǎn)生的顆粒狀、乳白色或淺黃色的生長較快的胚性愈傷組織接種到不同濃度玉米素的分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基分別添加3 mg／L、5 mg／L、7 mg／L的玉米素，每個培養(yǎng)皿放置25個胚性愈傷組織，3次重復(fù)。25℃持續(xù)光照，光強5 000 lx，21 d后統(tǒng)計幼苗分化率。

表 1 L9（33）試驗設(shè)計Table 1 L9（33）Orthogonal test designs table

幼苗分化率 ＝分化出的組織培養(yǎng)苗數(shù)／愈傷組織數(shù) ×100%

1.2.4 生根培養(yǎng)基中IBA濃度的確定

當待分化苗植株長到到2～3 cm后，將分化出的玉米幼苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中分別添加 0.1 mg／L、0.2 mg／L、0.3 mg／L、0.4 mg／L的 IBA，將待生根的幼苗置于25℃、3 000 lx進行光照培養(yǎng)，光周期為16 h／8 h。每次處理25株植株，3次重復(fù)。待再生植株高達5 cm左右，且具有3～5個新生根時進行統(tǒng)計。

1.2.5 煉苗與移栽

待幼苗長出3～5個主根時，打開瓶口進行煉苗，煉苗時培養(yǎng)基中倒入無菌水1～2 d后，用無菌水清洗幼苗根部殘留的培養(yǎng)基，再水培2～3 d后移栽至基質(zhì)中，移栽21 d以后調(diào)查成活，培養(yǎng)條件同生根培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化

愈傷組織誘導(dǎo)率（表2）和顯著性分析（表3）結(jié)果表明，L-Pro的濃度對愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)極顯著差異，當L-Pro的濃度為700 mg／L時，其愈傷誘導(dǎo)率為 83.77%，顯著高于 500 mg／L和600 mg／L時愈傷誘導(dǎo)率。2，4-D和 AgNO3的含量對愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)顯著性差異。2、4-D的濃度為1.5 mg／L時愈傷組織誘導(dǎo)率為73.27%，明顯高于濃度為1 mg／L和2 mg／L的愈傷誘導(dǎo)率；當AgNO3的為0.1 mol／L時，愈傷組織誘導(dǎo)率為71.4%；明顯高于 0.08 mol／L和0.12 mol／L處理。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳組合處理為L-Pro 700 mg／L、2、4-D 1.5 mg／L和 AgNO30.1 mol／L，誘導(dǎo)率達到98.60%。

2.2 玉米素的對幼苗分化的影響

將胚性愈傷組織接種到在含有 3 mg／L、5 mg／L、7 mg／L的玉米素的分化培養(yǎng)基上，3～5 d胚性愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠，7～10 d開始出現(xiàn)綠色芽點（圖1A），進而分化成幼苗（圖1B、圖1C）。玉米素可以促進胚性愈傷組織分化，本試驗研究表明培養(yǎng)基中添加5 mg／L玉米素時，其再生芽和再生植株分化率分別為97.96%和97.67%，明顯優(yōu)于培養(yǎng)基中添加3 mg／L和7 mg／L的玉米素時的分化率（表4）。

2.3 生根培養(yǎng)基中IBA濃度的確定

研究結(jié)果表明，當生根培養(yǎng)基中添加0.1 mg／L的 IBA時，根的長度大部分過于細長（圖2A），不利于再生植株的生長；當生根培養(yǎng)基中添加IBA的濃度大于0.3mg／L時，根生長緩慢且須根較少（圖2C、2D），不適合再生植株的生長，當生根培養(yǎng)基中添加0.2 mg／L的IBA時，根粗壯、須根較多并且生長迅速（圖2B），適合再生植株的生長，因此生根培養(yǎng)基中添加0.2 mg／L的IBA為適宜濃度。

2.4 煉苗與移栽

一般生根培養(yǎng)10 d左右，幼苗長到3～4片葉，將三角瓶移入人工氣候溫室中，打開瓶口并倒入無菌水，1～2 d后將根部殘留的培養(yǎng)基洗凈，再進行水培煉苗（圖2E），2～3 d后將幼苗轉(zhuǎn)移，移栽于經(jīng)過無菌處理的優(yōu)質(zhì)土壤中。移栽時，將幼苗葉片剪去少許，外面扣膜，以保持濕度。每2 d噴水1次，待有新葉長出時，逐漸通風去掉薄膜，此時小苗即可正常生長發(fā)育（圖2F）。21 d后成活率達到90%，獲得了較為理想的再生植株。

表2 三因素三水平正交試驗Table 2 Three factors and three levels orthogonal table

表3 顯著性分析Table 3 Significance analysis

表4 不同濃度玉米素對愈傷組織分化的影響Table 4 Effect of different ZT hormones on shootfornation ofmaize callus

圖1 胚性愈傷組織分化Figure 1 Embryonic callus differentiaton

表5 不同濃度IBA對無菌苗生根的影響Table 5 Effect of different IBA hormones on plantlet rooting

圖2 不同濃度的IBA生根的影響及煉苗移栽Figure 2：Effect of different IBA hormones on plantlet rooting注：A：IBA的濃度為0.1 mg／L；B：IBA的濃度為0.2 mg／L；C：IBA的濃度為0.3 mg／L；D：IBA的濃度為0.4 mg／L；E：煉苗；F：移栽Note：A：0.1 mg／L IBA concentration；B：0.2 mg／LIBA concentration；C：0.3 mg／LIBA concentration；D：0.4 mg／L IBAconcentration；E：Hardening-seedling；F：Transplanting

3 討論與結(jié)論

本試驗以授粉后7～12 d，1.0～1.2 mm大小的幼胚為受體材料，接種到9中不同的培養(yǎng)基，結(jié)果表明不同濃度的L-Pro、2、4-D和硝酸銀均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但最佳誘導(dǎo)愈傷組織的組合濃度為 L-Pro 700 mg／L、2、4-D 1.5 mg／L和 AgNO30.1 mol／L。說明當選用幼胚作為受體材料時，普遍可以誘導(dǎo)出愈傷，但其營養(yǎng)物質(zhì)和激素濃度對誘導(dǎo)愈傷的效率有很大的干預(yù)作用。

在分化階段，激素能夠誘發(fā)細胞分裂活性，引起細胞脫分化和無序增殖，產(chǎn)生愈傷組織［13］，在本試驗中，基本培養(yǎng)基中添加5 mg／L的玉米素可有效促進愈傷組織分化，再生芽和再生植株分化率分別達到97.96%和97.67%。

玉米組織的生根是再生體系的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有根系發(fā)達才能長成健壯的幼苗，培養(yǎng)基中IBA的添加可以促進根的生成。本試驗研究表明，在基本培養(yǎng)基中添加0.2 mg／L IBA，5 d左右后即可看到0.5～1.0 cm的粗壯的幼根，10 d以后即可煉苗移栽，如果環(huán)境條件適宜，移栽成話率也較高，能夠獲得比較理想的再生植株。

［1］ Kole C.Genomemapping andmolecular breeding in plants［J］.Spring-Verlag Berlin Heidelberg，2007，53（2）：105～119.

［2］ 張曼，吳穎，蘇勝忠，等.玉米莖節(jié)再生體系建立及AGPL基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究［J］.玉米科學(xué)，2016，24（3）：51～56.

［3］ 王志春，梁正偉.植物耐鹽研究概況與展望［J］.生態(tài)環(huán)境，2003，12（1）：106～109.

［4］ Zhang JF，F(xiàn)ang Y F，Makeschin，etal.A-groforestry and its application in elioration of saline soils in eastern China coastal region［J］.Energy and Industry，2002，10（1）：10～13.

［5］ 王金君，崔麗華.基因工程在玉米育種上的應(yīng)用［J］.國外農(nóng)學(xué)—雜糧作物，1999，19（6）：19～22.

［6］ Richard A Z，F(xiàn)red O.Corn grain for cattle：influence of processing on site and extent of digestion［J］.Southwest Nutrition，2005：86～112.

［7］ 賈秀萍，王漢寧，張金文，等.2，4-D和NAA對成熟玉米種子不同外植體胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，43（6）：48～51.

［8］ 王雷，張君，王丕武.胚齡和2，4-D濃度對玉米自交系幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響［J］.玉米科學(xué)，2001，9（3）：26～28.

［9］ 王奕，范俊山，尚麗霞，等.玉米幼胚再生體系的建立［J］.華北農(nóng)學(xué)報.2015，30（5）：130～134.

［10］ 馬海珍，朱偉偉，王啟柏，等.玉米幼苗不同部位的再生能力和某些影響因子［J］.作物學(xué)報.2014，40（2）313～319.

［11］ Sidorov V，Gilbertson L，Addae P，Duncan D.Agrobacteriummediated transformation of seedling-derived maize callus［J］.Plant Cell Rep，2006，25：320～328

［12］ Zhong H，Srinivasan C，Sticklen M B.In vitromorphogenesis of corn（Zeamays L.）：II.Differentiation of ear and tassel clusters from cultured shoot apices and immature inflorescences［J］.Planta，1992，187：490～497.

［13］ 姚丹，王丕武，劉占柱，等.玉米愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化和對草丁膦抗性及植株再生的研究［J］.玉米科學(xué)，2004（3）：33～35.

Study on the Establishment of High Efficiency Regeneration System of Maize

LIJin-hong1，2，HUO Yan1，3，F(xiàn)U Li3，TAO Cheng-guang1，SHIZhen-sheng2（1．Innovation Center，Liaoning Academy of Agricultrual Science，Shenyang，Liaoning 110161； 2．Special Corn Institute of Shenyang Agriculture University，Shenyang，Liaoning 110866； 3 Institute of Food，Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121000）

To establish high-frequency regenration technique system for gene tranformation inmaize，We studyed on callus induction rate in L-Pro、AgNO3and 2，4-D when immature embryo is used as amaterial；we also analyzed the effects of different concentrations of ZT and IBA hormone on differentiation and rooting，The results showed that the best callus induction rate is added to L-Pro 700 mg／L、AgNO30.1 mg／L and 2、4-D1.5 mg／L in bascimedium；regeneration buds rate and regeneration plants rate reached 97.96%and 97.67%respectively if the basicemediuim was added to 5 mg／L zeatin；The result of rooting was the best when basice meidum was added 0.1 mg／L IBA as the exogenous hormone.

Maize；Immature embryo；Callus-induced rate；Regeneration

S513.035.3

A

1002-1728（2017）06-0001-05

10.3969／j.issn.1002-1728.2017.06.001

2017-10-12

遼寧省企業(yè)博士后項目（137301）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06-01-06）；科技部其他項目（2016YFD0101803）

李金紅（1979-），女，博士 助理研究員，主要從事作物分子育種研究。E-mail：lijinhong＿0315＠163.com通訊作者：陶承光（1955-），男，博士，研究員，主要從事作物分子育種的研究。E-mail：laast＠vip.sina.com史振聲（1954-），男，博士，教授，從事玉米育種與栽培生理研究。E-mail：Shi.zhensheng＠163.com