以往對微生物分子生物學(xué)鑒別的方式，通常以微生物的理化性質(zhì)與形態(tài)進(jìn)行甄別，該方法存在的弊端是鑒定過程復(fù)雜且耗時。最近幾年以來，由于分子生物學(xué)的發(fā)展迅猛，更精準(zhǔn)、更科學(xué)、更簡捷的方法被挖掘而出——PCR技術(shù)。在分子生物學(xué)中，可增添PCR技術(shù)，譬如：在分析自動核糖體間隔基因分布、單鏈結(jié)構(gòu)的多態(tài)性與變性方面，其效果十分顯著。本論文著重闡述了多種有關(guān)于微生物分子生物學(xué)的甄別方式及其利弊之處。

最近幾年，越來越多的科學(xué)家開始對微生物分子生物學(xué)進(jìn)行探究，因為技術(shù)的落后，導(dǎo)致部分實驗備受阻隔。微生物分子生物學(xué)鑒定方法的產(chǎn)生，讓人類能夠以種屬的關(guān)系，繼而對不同的水生真核微生物實行區(qū)分，然而對于原核微生物而言，探究不多。由于原核微生物外形不大且種類繁多，不可進(jìn)行人工培育。因而，鑒定出是原核微生物的概率極小。值得一提的是基于微生物分子生物學(xué)鑒定方法之下，為進(jìn)一步鑒定原核微生物的種類與外在特征提供了一條捷道。在本論文之中，主要探究了不同水生微生物的分子生物學(xué)鑒定方式，簡單說明了PCR概念，核心在于闡述PCR技術(shù)、不依賴PCR技術(shù)的方法。

一、涉及PCR的分子生物學(xué)方法

對于生物科學(xué)而言，PCR技術(shù)的出現(xiàn)使得生物學(xué)有著突飛猛進(jìn)的改變，也增強(qiáng)了人類進(jìn)一步探究微生物的信心，目前，因為強(qiáng)大的敏感度、特異性PCR技術(shù)為探究微生物奠定了堅實基礎(chǔ)。由于PCR擴(kuò)增技術(shù)的不斷升級，使得多種科學(xué)的、敏感度強(qiáng)、先進(jìn)的方法也59c3beb2817975fd5ccf4cdd99bd8913逐漸被研發(fā)。譬如：實時熒光PCR、觸減PCR、嵌套PCR、最小循環(huán)數(shù)PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等。在此之中，實時熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)能夠以定量方面來鑒定微生物的類別，當(dāng)然該方式的可測定任何周期內(nèi)微生物的狀態(tài)，其也可對靶基因進(jìn)行篩選與提取。假如總DNA中的靶基因含量不少，PCR擴(kuò)增技術(shù)很快就能完成鑒定任務(wù)。在基于反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增技術(shù)之下，為了獲取較多的目的基因，可采用獨特的引物進(jìn)行擴(kuò)增。對于RT-PCR而言，其可視為敏感度高、活性強(qiáng)的擴(kuò)增技術(shù)，其能夠鑒定較多的RNA活性組織。對于觸減PCR 擴(kuò)增技術(shù)而言，在各個階段中退火溫度會一直呈遞減趨勢，但是退火的初始溫度高于Tm，之后也呈遞減趨勢。此種方式效果明顯且效率高。當(dāng)前，對于微生物分子生物學(xué)的鑒定方法來講，毫無疑問PCR擴(kuò)增技術(shù)是最理想、最優(yōu)化、最迅速的鑒定方式之一，然而其自身存在一定的弊端。

二、基于PCR的分子生物學(xué)方法

2.1 克隆文庫中的隨機(jī)測序

對于克隆文庫中的隨機(jī)測序來講，首先是基于PCR擴(kuò)增技術(shù)下對生成物的克隆，之后正式進(jìn)入克隆文庫中的隨機(jī)測序。經(jīng)過隨機(jī)測序之后，可初步鎖定PCR擴(kuò)增生成物里的優(yōu)勢進(jìn)行數(shù)據(jù)備份，將測序與文庫數(shù)據(jù)進(jìn)行對照，通過比對之后確定并剖析該類微生物特性與已知微生物特性的異同之處，繼而鑒定微生物的類別?？寺∥膸熘械碾S機(jī)測序?qū)嶒炇状问怯蓢鈱W(xué)者Giovannoni 所提出，并采用該技術(shù)對16SrDNA進(jìn)行精準(zhǔn)定位，檢測出海底細(xì)菌的多樣性。國外學(xué)者Zwart等人對歐洲等地區(qū)進(jìn)行了類似實驗，研究發(fā)現(xiàn)淡水細(xì)菌基本遍布了全世界。

2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA具體指的是應(yīng)用多種單鏈作為引物，隨機(jī)分配，然后通過基因組的DNA實行PCR擴(kuò)增，最后達(dá)到鑒定微生物的多樣性。當(dāng)遺傳特性出現(xiàn)改變之時，對各個隨機(jī)引物均實行PCR 擴(kuò)增操作，致使生成物出現(xiàn)明顯差異，因為采用大量的隨機(jī)引物，最終全部基因組的差異表現(xiàn)的十分顯著。在此之中，運用單一隨機(jī)引物，對精準(zhǔn)性不高且呈現(xiàn)多態(tài)的DNA實行PCR擴(kuò)增的時候，能夠與靶DNA的多個位點實行隨機(jī)退火處理，換句話說，隨機(jī)引物與DNA之間的序列不能互補(bǔ)。部分DNA帶能夠通過隨機(jī)引物，在退火處理之下進(jìn)行反向擴(kuò)增。即使隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)反應(yīng)靈敏，然而其存在的弊端在于可重復(fù)性、穩(wěn)定性欠佳。因而，雖然隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)效果良好，但使用條件相對于其他方法更加苛刻，并未得到普及。

三、不涉及PCR的分子生物學(xué)方法

3.1 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)具體指的是基于核酸序列之上，檢測細(xì)胞內(nèi)和特異互補(bǔ)核酸序列之間的融合情況，，并采用帶有熒光的探針進(jìn)行監(jiān)控。帶有熒光的探針能夠設(shè)置為一類物種特異，其可被視為界特異的互補(bǔ)序列、特異序列。因為探針具備一定的滲透性，繼而細(xì)胞可被良好的固定及處理，讓探針得以在特異位點處準(zhǔn)確實行雜交技術(shù)。通常來講，對細(xì)菌特殊基因組、細(xì)菌特異性兩處的探針是共同發(fā)力的。通過雜交技術(shù)之后，可采用熒光顯微鏡來觀察微生物。雖然熒光原位雜交技術(shù)存有巨大優(yōu)勢，在探究普通樣品的時候，之所以誤差依然存在，是因為測驗受探針的選取、周圍環(huán)境、熒光染料等多方面的影響。

3.2 DNA聯(lián)合剖析技術(shù)

DNA聯(lián)合剖析技術(shù)具體指的是應(yīng)用單一群體之中的差異序列進(jìn)行對比或兩個生物群體之中的所有DNA序列進(jìn)行逐一對比。針對以上兩類方式，均需對群體的所有DNA實行提純，將某一個群體的DNA標(biāo)記為放射性且視為鏈模板。兩類DNA樣品之中出現(xiàn)交叉性雜交的均被使用，當(dāng)然相似度也可被準(zhǔn)確識別。為了進(jìn)一步探究序列的分布，將要對DNA相似序列、DNA變性單鏈實行聯(lián)合分析，最終識別DNA性質(zhì)與基因組的數(shù)量。

四、結(jié)論和展望

對于PCR技術(shù)來講，避免了去創(chuàng)建克隆基因文庫這一環(huán)節(jié)，可以說該技術(shù)變得更加科學(xué)，因而在鑒定微生物群體多樣性的時候，PCR技術(shù)提供了巨大幫助。但是該類技術(shù)僅可單純的識別物種的類別，并不能細(xì)致的分析微生物的生態(tài)與代謝情況。目前，對于分子生物學(xué)的探究還未達(dá)到成熟階段，在之后的研究之中可能研發(fā)更加高效的新興技術(shù)，進(jìn)一步探究微生物的生態(tài)功能、代謝情況以及生物多樣性。

（作者單位：延安大學(xué)西安創(chuàng)新學(xué)院）