李彤，張聰，張佳鑫，黃根勇，成永旭，王春，楊志剛，楊筱珍

（上海海洋大學省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

中華絨螯蟹腸道內(nèi)間質(zhì)樣細胞的顯微和超微結(jié)構觀察

李彤，張聰，張佳鑫，黃根勇，成永旭，王春，楊志剛，楊筱珍*

（上海海洋大學省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

目的探究中華絨螯蟹（Eriocher sinensis）腸道中是否存在間質(zhì)樣細胞。方法通過對中華絨螯蟹中腸和后腸進行全層鋪片和腸cajal間質(zhì)細胞（interstitial cells of cajal, ICC）特殊染色法碘化鋅-鋨酸（zinc iodide-osmium, ZIO）染色，并結(jié)合后腸透射電鏡觀察中華絨螯蟹后腸ICC樣細胞分布及形態(tài)。結(jié)果光鏡檢查結(jié)果顯示：中華絨螯蟹間質(zhì)樣細胞常分布在中腸和后腸的黏膜下層。這些細胞形態(tài)相似，多為圓形或卵圓形，胞體直徑約為10μm左右，呈灰黑色，常成群呈塊狀或片狀分布，在后腸中的分布更為密集。電鏡檢測結(jié)果顯示：這些細胞分布于黏膜下層、肌層與肌層之間和肌肉束邊緣。后腸中間質(zhì)樣細胞多為梭形及紡錘形，也有不規(guī)則型，常有兩個或兩個以上突起，與鄰近的細胞連接方式多為縫隙連接。此外，本研究還在后腸腸道固有膜層、肌層間和黏膜下層發(fā)現(xiàn)了大量顆粒細胞的分布。結(jié)論本研究通過傳統(tǒng)的特異性ZIO染色和超微形態(tài)的觀察初步發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹腸道內(nèi)有ICC樣細胞的分布。

中華絨螯蟹；腸道；ICC樣細胞；碘化鋅-鋨酸染色；透射電鏡

腸間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal，ICC細胞)是1893年西班牙神經(jīng)解剖學家Cajal應用甲基藍和嗜銀染色法首次在在豚鼠(Caviaporcellus) 和家兔(Oryctolagus cuniculus) 小腸中發(fā)現(xiàn)的一種來源于中胚層的特殊間質(zhì)細胞，以網(wǎng)狀形式廣泛分布于哺乳動物的消化管壁內(nèi)，在調(diào)控胃腸運動中具有重要作用。雖然在水產(chǎn)動物鱉(pelodiseussinensis)[1]中ICC樣細胞已有報道，但在甲殼動物中還未見有報道。消化道全層鋪片技術作為經(jīng)典研究哺乳動物腸道神經(jīng)系統(tǒng)的方法之一，已經(jīng)應用于研究甲殼動物消化道的研究[2]。本研究參照楊筱珍等[2]腸壁鋪片法對我國特有的經(jīng)濟類甲殼動物中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的中腸及后腸不同層分離并結(jié)合碘化鋅—鋨酸（zinc iodide-osmium，ZIO）染色法對ICC樣細胞進行染色，對ICC樣細胞形態(tài)與分布進行初步觀察，ICC細胞的鑒定方法層出不窮，但是透射電鏡法是認可度最高的方法之一[3]，本文通過透射電鏡的方法觀察后腸的超微形態(tài)，以期為甲殼動物腸道收縮相關細胞的研究奠定初步基礎。

材料與方法

1 動物

2015年11月從上海市崇明中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地隨機挑選成年中華絨螯蟹（蟹體重82～134g）10只，實驗動物均活力良好，無斷肢現(xiàn)象，體表無明顯損傷。

2 碘化鋅-鋨酸染色

參照Komuro等（1996年）應用的腸道間質(zhì)細胞的染色方法，進行染液配制[4]。首先將2%的鋨酸溶液與3%碘化鋅溶液按l：3混合。兩者均新鮮配制，新鮮混合。染色時，將新鮮5只中華絨螯蟹中腸和后腸迅速置于鋨酸—碘化鋅作用液中孵育24h（室溫，不避光）后，將腸道在自來水中沖洗1h，對中華絨螯蟹中腸和后腸的基膜、肌層和黏膜下層分別進行鋪片。顯微鏡下觀察，間質(zhì)細胞常呈灰黑色。

3 透射電鏡樣品制備

5只中華絨螯蟹后腸用河蟹生理鹽水 (NaCl 14.5g; KCl 0.355g;無水CaCl20.899g; MgSO4.7H2O 1.58g; NaHCO30.25g; MgCl2.6H20 0.85g; HEPES 2.38g) 加超純水至500ml沖洗后，固定于4℃預冷的2.5%戊二醛溶液中，1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，丙酮置換，Epon812包埋，經(jīng)醋酸鈾檸檬酸鉛雙染色，日立H-7650透射電鏡觀察并拍照。

結(jié) 果

1 腸鋪片下腸壁內(nèi)間質(zhì)樣細胞的形態(tài)與分布

通過對腸壁基膜、黏膜下層和肌層鋪片進行碘化鋅-鋨酸染色觀察后發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)樣細胞僅存在于中腸黏膜下層（圖1A）和后腸的黏膜下層（圖1B）。該細胞為圓形或卵圓形，胞體直徑約為10μm，呈灰黑色，常成群呈塊狀或片狀分布；在基膜內(nèi)未見有該細胞的分布（圖1C）。由于肌層有條紋狀肌纖維規(guī)律的分布，未能成功觀察到此種細胞（圖1D）。

比較中腸和后腸內(nèi)間質(zhì)樣細胞的形態(tài)后發(fā)現(xiàn)，在兩種組織中間質(zhì)樣細胞的形態(tài)較為接近。僅見后腸分布更為密集（圖1A和圖1B）。

圖1 中華絨螯蟹腸道間質(zhì)細胞的形態(tài)與分布（ZIO染色）。A，間質(zhì)樣細胞在中腸黏膜下層的分布；B，間質(zhì)樣細胞在后腸黏膜下層的分布；C，基膜內(nèi)未出現(xiàn)明顯ICC樣細胞；D，肌層內(nèi)未出現(xiàn)明顯ICC樣細胞；比例尺：A和B，50μm；C和D，100μmFig. 1 Morphology and distribution of interstitial cells of Cajal (ICCs) in the intestine of Eriocheir Sinensis (ZIO stain). A, distribution of ICCs in the midgut submucosa; B, distribution of ICCs in the hindgut submucosa; C, no ICC-like cells in intestinal basement membrane; D, no ICC-like cells in intestinal muscle layer; scale bar: 50μm in A and D; 100μm in C and D

2 透射電鏡下間質(zhì)樣細胞的形態(tài)與分布

中華絨螯蟹后腸的間質(zhì)樣細胞多為梭形及紡錘形，也有不規(guī)則形，常有兩個或兩個以上突觸，與鄰近的細胞連接方式多為縫隙連接（圖2A）。細胞膜常呈層疊狀。胞核較大，胞質(zhì)較少。胞核異染色質(zhì)明顯，電子密度較高，常貼近核膜分布。胞質(zhì)中富含線粒體。該細胞分布部位多樣，常分布于黏膜下層（圖2B）、肌層與肌層之間（圖2C）和肌肉束邊緣（圖2D），在各部位的間質(zhì)樣細胞形態(tài)上并無明顯差異。

此外，在中華絨螯蟹后腸中也發(fā)現(xiàn)了大量顆粒細胞的分布，細胞主要形態(tài)為圓形或卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)有大量高電子密度大小不一的圓形或卵圓形顆粒。常分布在固有膜層、肌層間和黏膜下層（圖2E-G）。

圖2 中華絨螯蟹腸道間質(zhì)細胞和顆粒細胞超微結(jié)構特征。A，間質(zhì)樣細胞與周圍細胞間的縫隙連接（箭頭示）；A’，A中箭頭處放大；B，黏膜下層下的間質(zhì)樣細胞；C，肌間間質(zhì)樣細胞；D，肌束邊緣間質(zhì)細胞；E，固有膜內(nèi)成群的顆粒細胞（箭頭示）；F，肌層間顆粒細胞（箭頭示）；G，黏膜下層的顆粒細胞（箭頭示）；N，間質(zhì)樣細胞細胞核；EC，腸上皮細胞；SM，平滑肌細胞；MB，肌束；c，角質(zhì)層；比例尺：A和A'，2μm；B—D和F，5μm；E和G，10μmFig. 2 Ultrastructure characters of interstitial cells of Cajal (ICCs) and granulocytes in the intestine of Eriocheir Sinensis. A, gap junctions between ICCs and their neighboring cells indicated by arrows; A’, enlarged image of the region indicated by arrows in A; B, ICCs in the submucosal tissue; C,Intermuscular ICCs; D, ICCs around muscle bundles; E, granulocytes in the lamina propria; F, intermuscular granulocytes; G, granulocytes in the submucosal tissue; N, the nucleus of ICC; EC, epithelial cells; SM, smooth muscle cell; MB, muscle bundle; Cu, cuticle. Scale bar, 2μm in A and A’; 5μm in B to D and F; 10μm in E and G

討 論

ICC細胞是胃腸平滑肌的收縮起搏細胞，調(diào)控著胃腸道的基本電節(jié)律，且在胃腸道運動中發(fā)揮著重要的功能。目前有關ICC細胞的形態(tài)與功能的研究在哺乳動物鼠(Mus culus)[5]、豬(Sus scrofa)[6]、水產(chǎn)動物鱉[1]等中已有大量報道。其形態(tài)雖然在不同種屬及胃腸道的不同部位存在一定差異，但此類細胞的形態(tài)具有一定的相似性特征。目前已公認ZIO染色法[7]和特征性的超微結(jié)構是識別ICC細胞的傳統(tǒng)方法。ICC細胞的超微結(jié)構常有以下幾個典型特征：1）細胞突起明顯；2）細胞間常為縫隙連接；3）胞漿中廣泛分布內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體，基底膜不連續(xù)存在，并且質(zhì)膜為穴樣凹陷；4）胞核中異染色質(zhì)較多[8]。我們之前的大量研究已表明，中華絨螯蟹腸道組織結(jié)構有明顯的特殊性，如其中腸無明顯固有層、后腸有較厚的肌肉層、中腸與后腸均為直線形且兩部分之前有腸球連接等[9]。但其功能與其它動物是否存在差異，有何種差異還有待于進一步證實。經(jīng)過大量研究，我們已在中華絨螯蟹腸道中發(fā)現(xiàn)有肥大細胞、5-HT和5-HT受體2的分布，同時研究表明外源組織胺能影響腸道消化功能和結(jié)構[9-13]。本研究通過借助傳統(tǒng)識別ICC細胞的方法，初步發(fā)現(xiàn)在中腸和后腸內(nèi)均有ICC樣細胞的分布。在光鏡下僅見黏膜下層有分布，這與趙柳蘭等[11]發(fā)現(xiàn)此層也是后腸肥大細胞常出現(xiàn)在部位相類似。我們認為由于肌肉層厚于黏膜下層，可能是本研究通過腸道鋪片未能觀察到這一細胞的原因之一。此后，通過電鏡觀察所獲得的ICC樣細胞其超微結(jié)構符合已報道的其它動物ICC細胞的特征，其中包括細胞常見突起、細胞間及與平滑肌細胞間可見縫隙連接，除此之外，我們在超微結(jié)構觀察下還發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹ICC樣細胞細胞膜常呈層疊狀。結(jié)合光鏡下特異性染色的觀察，我們初步認為我們所觀察的細胞為腸間質(zhì)細胞。雖然這類細胞并未發(fā)現(xiàn)有以往對腸道間質(zhì)細胞所描述的胞膜存在小凹及不連續(xù)的基膜的結(jié)構，但這樣的差異也許與種屬特異性有關。

ICC 分類方法很多，目前的研究多以 Sanders的分類為參照標準，此方法主要根據(jù)ICC細胞的分布部位來分類，共分為四類：1) 腸肌叢 ICC（myenteric ICC，ICC-MY），位于環(huán)肌層和縱肌層之間；2) 深肌層叢ICC（deep muscular plexus ICC，ICC-DMP），位于環(huán)肌較厚的外層與較薄的內(nèi)層之間；3) 黏膜下ICC）（submucosal ICC，ICC-SM），位于環(huán)肌與黏膜下層間；4)肌內(nèi) ICC（intramuscular ICC，ICCIM），位于環(huán)形肌肌束內(nèi)與縱形肌肌束內(nèi)。由于中華絨螯蟹腸道結(jié)構與哺乳動物有很大差異，肌肉層很薄，且僅在后腸中較為發(fā)達[9]。結(jié)合本研究超微結(jié)構的觀察，我們將中華絨螯蟹的ICC樣細胞分為三類，它們分別為：1）分布在肌層細胞間的ICC樣細胞；2）黏膜層與黏膜下層間的ICC樣細胞；3）肌肉束邊緣的ICC樣細胞。不少學者[14]已對不同胃腸道不同部位的各種類型ICC功能進行研究后發(fā)現(xiàn)，同一類型ICC在不同部位中功能存在差別，如：ICCMY 是胃和小腸的起搏細胞，能自動去極化，產(chǎn)生電慢波節(jié)律；而結(jié)腸的起搏細胞為 ICC-SM；ICC-IM和小腸的 ICC-DMP 及結(jié)腸的 ICC－MY 則參與介導興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞，與胃腸運動神經(jīng)調(diào)控密切相關。綜上，在中華絨螯蟹后腸中此三種ICC樣細胞的功能如何還有待于進一步澄清。

本研究通過電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹腸道固有膜層、肌層間和黏膜下層內(nèi)有單個或成群分布的顆粒細胞。此類細胞形態(tài)特征與肥大細胞非常相似如分布在血管外的組織內(nèi)、常成群分布、胞體圓而大，胞核偏于胞體的一側(cè)，胞質(zhì)中充滿高電子密度的圓形或卵圓形顆粒等。目前有關此類細胞已在多種動物腸道內(nèi)有分布且發(fā)揮著腸道免疫的防疫功能[15]。我們通過甲苯胺藍以及阿爾新藍-番紅染色法發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹后腸中有肥大細胞陽性細胞的分布[11]。由于蟹類是開放式循環(huán)，此類細胞是否為血細胞中的顆粒細胞還是與其它動物所述的肥大細胞一致還需進一步驗證，而其在腸道中發(fā)揮的生理作用還有待于進一步證明。

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Microstructure and ultrastructure of the interstitial cells in the intestine of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)

Li Tong, Zhang Cong, Zhang Jiaxin, Huang Genyong, Cheng Yongxu, Wang Chun, Yang Zhigang, Yang Xiaozhen*
( Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306，China)

ObjectiveTo explore the existence of interstitial cells of cajal (ICCs) in the intestine of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis ).MethodsThe distribution and morphology of ICC cells from the intestine ofEriocheir sinensiswere studied using both light and transmission electron microscopy through whole mount prepared and zinc iodide osmium (ZIO) stained mid- and hindgut tissue samples.ResultsICCs mainly distributed in the submucosa of midgut and hindgut under light microscopy. These grayish black cells were similar in shape which were round or oval with a diameter of around 10 μm. Cells grew in clusters or patches. The cell density in the hindgut was higher than that in the midgut. Under electron microscope, ICCs mainly distributed in submucosa, between muscle layers, or around muscle bundles. They were either spindle-like or irregular with two or more projections and connected with adjacent cells mostly through gap junctions. In addition, a large number of granulosa cells were found in the lamina propria, muscular layers and submucosa of hindgut.ConclusionThe existence of ICC cells was con firmed in the intestine ofEriocheir sinensiswith distinct distribution and morphology.

Eriocheir sinensis; gut; interstitial cells of Cajal; ZIO; ultrastructure

Q952.4

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 06. 003

2017-05-28

2017-12-06

國家自然科學資金（31272677；31472287）；上海市科委項目：上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術研究中心

（16DZ2281200）；上海市高校知識服務平臺（ZF1206）；水產(chǎn)動物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心(ZF1206)；上海市科技興農(nóng)推廣項目：中華絨螯蟹養(yǎng)殖技術的推廣應用滬農(nóng)科推字(2015)第1-7號

李彤，女（1990年），漢族，碩士研究生

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：xzyang@shou.edu.com