酸解52 ℃棕櫚硬酯制備1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的工藝研究

李世磊，惠 菊，初柏君，尚嘉毅，劉孟濤，王翔宇,*

1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司 (北京 102209)2.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (北京 102209)

酸解52℃棕櫚硬酯制備1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的工藝研究

李世磊1,2，惠 菊1,2，初柏君1,2，尚嘉毅1,2，劉孟濤1,2，王翔宇1,2,*

1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司 (北京 102209)2.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (北京 102209)

1，3-二油酸-2 -棕櫚酸甘油三酯(OPO)是母乳脂肪中重要的組成部分。目前，針對(duì)其合成路線的研究，主要通過(guò)兩步法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)以熔點(diǎn)為52 ℃的棕櫚硬酯為酰基受體、食品級(jí)油酸為酰基供體，采用Lipozyme RM IM脂肪酶為催化劑，通過(guò)一步法制備OPO。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，得到最佳反應(yīng)條件為: 底物摩爾比1∶10，反應(yīng)溫度56 ℃，酶添加量10%，加水量1%，反應(yīng)時(shí)間4 h。在最佳條件下所制備的OPO產(chǎn)品中，sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的含量為57.73%，OPO含量為45.23%，PPP的含量為3.86%。

1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯；52 ℃棕櫚硬酯；制備工藝

母乳是嬰幼兒成長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最理想的食物和能量來(lái)源，可為嬰幼兒提供生長(zhǎng)所需的碳水化合物、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。脂肪是母乳中最重要的組成成分之一，其含量約占母乳質(zhì)量的4%，卻提供了嬰幼兒生長(zhǎng)所需能量的50%～60%。母乳中的脂肪主要以甘油三酯的形式存在[1-2]，不同于常見(jiàn)的植物油脂，母乳脂肪中，以棕櫚酸為主的飽和脂肪酸主要分布在甘油三酯的sn-2位，而油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸主要分布在甘油三酯的sn-1,3位[3-4]。研究表明，1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)是母乳脂肪中重要的組成部分。同時(shí)，OPO這種具有特定脂肪酸分布結(jié)構(gòu)的甘油三酯，能夠促進(jìn)嬰幼兒對(duì)鈣的吸收，避免體內(nèi)皂鈣的形成，顯著地降低嬰幼兒便秘等癥狀[5-8]。

此前的研究中，制備OPO的原料可分為兩類(lèi):與母乳脂肪酸組成接近的動(dòng)物油脂，如豬油；甘油骨架上存在大量棕櫚?；闹参镉椭?，如棕櫚硬脂[9-11]。然而，上述方法存在一定的局限性。使用豬油作為原料，無(wú)法通過(guò)HALAL清真認(rèn)證；同時(shí)，動(dòng)物油脂在提煉、貯存過(guò)程中存在諸多困難，導(dǎo)致其無(wú)法應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)[12-13]。使用棕櫚硬脂合成OPO主要通過(guò)兩步法來(lái)實(shí)現(xiàn)：首先，將棕櫚硬脂進(jìn)行隨機(jī)酯交換處理，得到sn-2位富含棕櫚?；母视腿?；隨后，與油酸進(jìn)行酸解反應(yīng)，從而制備OPO產(chǎn)品。此方法在制備OPO的過(guò)程中,需要利用兩種生物酶作為催化劑，提高了生產(chǎn)成本，可推廣性不強(qiáng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，一種經(jīng)棕櫚油分提得到、熔點(diǎn)為52 ℃的棕櫚硬脂，其甘油骨架上，尤其是sn-2位上，富含棕櫚?；侵苽銸PO的理想原料。將其與油酸含量為80 %的脂肪酸混合，經(jīng)一步酶法酸解酯交換反應(yīng)即可制備OPO，可以有效節(jié)約生產(chǎn)成本，并提高生產(chǎn)效率。

本文以52 ℃棕櫚硬脂為酰基受體，食品級(jí)油酸為酰基供體，采用Lipozyme RM IM脂肪酶為催化劑，通過(guò)酶法催化酸解反應(yīng)制備OPO。之后，采用薄層色譜、氣相色譜等分析方法對(duì)產(chǎn)品中總棕櫚酸含量、sn-2棕櫚酸含量及OPO含量(以C52計(jì))。通過(guò)分析產(chǎn)物的總棕櫚酸含量、sn-2棕櫚酸含量、C52含量、C48含量，并計(jì)算sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的比例，確定出酶法催化酸解反應(yīng)制備OPO的最優(yōu)的條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

52 ℃棕櫚硬脂：東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司；油酸，食品級(jí)：印尼春金集團(tuán)；脂肪酶Lipozyme RM IM：諾維信(中國(guó))投資有限公司。

薄層層析硅膠板，購(gòu)于青島海洋化工有限公司；乙醚、膽酸鈉、氯化鈣、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鉀、甲醇、氯化鈉、鹽酸、乙酸等均為分析純?cè)噭?，?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟化硼甲醇試劑、三羥甲基氨基甲烷、2,7-二氯熒光素、正己烷(色譜純)購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；十七碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.9%；1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.9%，購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海) 貿(mào)易有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

Agilent7890B型氣相色譜儀，配有FID檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司；TDL-40B臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)，上海安亭儀器有限公司；2838型水浴鍋，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；IKA HS7 加熱磁力攪拌器，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1脂肪酶催化制備OPO

取一定摩爾比的52 ℃棕櫚硬脂與油酸，置于恒溫水浴中，以450 r/min攪拌至混合均勻，加入Lipozyme RM IM脂肪酶后，待反應(yīng)結(jié)束，離心去除脂肪酶，獲得產(chǎn)物。

1.3.2總脂肪酸組成分析

通過(guò)薄層色譜法進(jìn)行甘油三酯的分離。取100 mg待測(cè)樣品,加入100 μL正己烷稀釋?zhuān)c(diǎn)樣后置于層析缸中進(jìn)行薄層層析。層析液為正己烷∶乙醚∶乙酸 = 80∶20∶1 (v/v/v)。刮取甘油三酯條帶，根據(jù)GB 5009.168—2016甲酯化方法處理后，用氣相色譜分析待測(cè)樣品的總脂肪酸組成。

氣相色譜條件：色譜柱,Agilent HP-88毛細(xì)管柱，100.0 m×250 μm×0.25 μm；進(jìn)樣器溫度270 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，載氣為氮?dú)猓至鞅?00∶1，進(jìn)樣體積1.0 μL；程序升溫,初始溫度100 ℃，持續(xù)13 min；100 ℃～180 ℃,升溫速率10 ℃/min，保持6 min；180 ℃～200 ℃，升溫速率1 ℃/min，保持20 min；200 ℃～230 ℃，升溫速率4 ℃/min，保持10.5 min。

1.3.3sn-2位脂肪酸組成分析

用乙醚提取出經(jīng)薄層層析色譜法分離出甘油三酯于離心管中。依次向離心管中加入7 mL Tris-HCl緩沖液(pH =8.0,1 mol/L)、2 mL膽酸鈉溶液、1 mL氯化鈣溶液以及20 mg豬胰脂酶，在40 ℃水浴下靜置9 min，期間每3 min振蕩1次。待溶液降至室溫后，加入2 mL乙醚充分振蕩。經(jīng)離心，取乙醚層，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后，用薄層層析色譜法分離出sn-2單甘酯，層析液為正己烷∶乙醚∶乙酸=50∶50∶1(v/v/v)。根據(jù)GB 5009.168—2016甲酯化方法處理后，待測(cè)樣進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)

1.3.4OPO(以C52記)及PPP(以C48記)含量的分析

根據(jù)GB 30604-2015中OPO(以C52記)及PPP(以C48記)含量的分析方法，首先，制備十七碳酸甘油三酯、棕櫚酸甘油三酯、1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯混標(biāo)樣品(0.2 mg/mL)。之后，以十七碳酸甘油三酯(0.2 mg/mL)為內(nèi)標(biāo)，用氣相色譜分析待測(cè)樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算OPO(以C52記)及PPP(以C48記)含量。

氣相色譜條件：色譜柱，Agilent DB-1HT毛細(xì)管柱，15.0 m×250 μm×0.1 μm；進(jìn)樣口溫度320 ℃，檢測(cè)器溫度370 ℃，載氣為氮?dú)猓銐耗Ｊ?，進(jìn)樣體積1.0 μL；升溫程序，300 ℃保持3 min，以20 ℃/min的速率升至380 ℃，保持10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)底物脂肪酸分析

ST52的脂肪酸組成分析結(jié)果如表1所示。

表1 ST52脂肪酸組成分析

表2 油酸組成分析

從表1可以看出，ST52中sn-2位棕櫚酸含量達(dá)到了41.70%，這是合成高含量OPO的基礎(chǔ)。然而，sn-2位棕櫚酸僅占總棕櫚酸的22.71%，說(shuō)明仍有大量棕櫚酸分布在sn-1,3位。因此，在制備OPO的過(guò)程中，需要降低sn-1,3位的棕櫚酸含量。食品級(jí)油酸中油酸含量高達(dá)78.81%(見(jiàn)表2)，是良好的油酸?；w。因此，以ST52與高純度油酸為反應(yīng)底物，在sn-1,3專(zhuān)一性脂肪酶的催化作用下，用油酸取代ST52中sn-1,3的棕櫚酸，可作為一條簡(jiǎn)單易行又可節(jié)約成本的OPO制備路線。

2.2 底物摩爾比的影響

將ST52與食品級(jí)油酸以不同的摩爾比混合，加入占底物總質(zhì)量10%的脂肪酶 Lipozyme RM IM，在56 ℃下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，并在反應(yīng)進(jìn)行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時(shí)取樣檢測(cè)。氣相分析脂肪酸組成結(jié)果如圖1所示。

圖1 底物摩爾比對(duì)棕櫚酸含量、sn-2棕櫚酸含量、C52含量、C48含量的影響

從圖1中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物中總棕櫚酸的含量逐漸降低，并在4 h后趨于穩(wěn)定，且底物中油酸所占比例越大，產(chǎn)物中總棕櫚酸的含量越低。這表明，反應(yīng)過(guò)程中油酸取代了ST52中的棕櫚酸，且油酸添加量越多，其所取代的棕櫚酸也越多。反應(yīng)中sn-2位棕櫚酸的含量隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)及底物中油酸占比增加而下降，這說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)了?；D(zhuǎn)移。并且，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)和油酸所占比例的增加，對(duì)?；D(zhuǎn)移均有促進(jìn)作用。通過(guò)計(jì)算sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比發(fā)現(xiàn)，隨著油酸比例的增加，sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比也在增加。但相比于底物比為1∶6和1∶8，底物比為1∶10、1∶12、1∶14時(shí)，增長(zhǎng)幅度較緩，這說(shuō)明過(guò)量油酸對(duì)反應(yīng)促進(jìn)作用逐漸減小。分析產(chǎn)物中C52及C48的含量發(fā)現(xiàn)，五組反應(yīng)產(chǎn)物的C52含量均高于40%且C48含量低于10%。綜合以上數(shù)據(jù)分析，并參考反應(yīng)原料的成本，選擇底物摩爾比1∶10為最適底物比。

2.3 反應(yīng)溫度的影響

將ST52與食品級(jí)油酸以摩爾比1∶10混合，加入占底物總質(zhì)量10%的脂肪酶 Lipozyme RM IM，在不同溫度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，并在反應(yīng)進(jìn)行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時(shí)取樣檢測(cè)。氣相分析脂肪酸組成結(jié)果如圖2所示。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)棕櫚酸含量、sn-2棕櫚酸含量、C52含量、C48含量的影響

從圖2可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增加，產(chǎn)物中總棕櫚酸的含量在不斷降低，并在4 h左右趨于平衡。這說(shuō)明反應(yīng)溫度升高能夠提升的酶法酯交換的效率，使得更多的油酸取代了棕櫚硬酯分子結(jié)構(gòu)中的棕櫚酸。然而，反應(yīng)溫度升高也會(huì)導(dǎo)致sn-2棕櫚酸含量降低，這說(shuō)明溫度升高將增加酰基轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)生，在60 ℃和64 ℃下，sn-2棕櫚酸的含量下降速度明顯加快，這說(shuō)明過(guò)高的溫度不利于反應(yīng)的進(jìn)行。通過(guò)計(jì)算sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比發(fā)現(xiàn)，在3 h以?xún)?nèi)，sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比隨著反應(yīng)溫度的增長(zhǎng)而增加，而3 h后，反應(yīng)溫度為60 ℃和64 ℃時(shí)，sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比迅速降低。在反應(yīng)趨于平衡(4 h)時(shí)，反應(yīng)溫度為56 ℃，sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比最高。分析產(chǎn)物中C52及C48的含量發(fā)現(xiàn)，五組反應(yīng)產(chǎn)物的C52含量均高于40%且C48含量低于10%。綜合以上數(shù)據(jù)分析，選擇56 ℃為最適反應(yīng)溫度。

2.4 酶添加量的影響

將ST52與食品級(jí)油酸以1∶10的摩爾比混合，加入占底物總質(zhì)量不同比例的脂肪酶Lipozyme RM IM，在56 ℃下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，并在反應(yīng)進(jìn)行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時(shí)取樣檢測(cè)。氣相分析脂肪酸組成結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物中總棕櫚酸的含量在不斷降低，但各組反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)的時(shí)間不同。酶添加量為5%和10%時(shí)，酯交換反應(yīng)在4 h達(dá)到平衡，而當(dāng)酶添加量15%、20%、25%時(shí)，反應(yīng)在3 h時(shí)達(dá)到平衡。因此，酶添加量增加會(huì)提升反應(yīng)速度，使反應(yīng)更快的達(dá)到平衡狀態(tài)。

圖3 酶添加量對(duì)棕櫚酸含量、sn-2棕櫚酸含量、C52含量、C48含量的影響

然而，酶量的增加意味著體系內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)數(shù)量會(huì)增加，相應(yīng)的副反應(yīng)數(shù)量也會(huì)更多，?；D(zhuǎn)移出現(xiàn)的概率也會(huì)增大。當(dāng)酶添加量為15%、20%、25%時(shí)，sn-2位棕櫚酸的含量在一定時(shí)間后迅速降低。通過(guò)計(jì)算sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶添加量為5%和10%時(shí)，sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比會(huì)隨著反應(yīng)的進(jìn)行而增加，并在4 h后趨于穩(wěn)定；而當(dāng)酶添加量為15%、20%、25%時(shí)，sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比在3 h前趨于穩(wěn)定，而后快速降低，這說(shuō)明酶添加量的增加促進(jìn)了?；D(zhuǎn)移的發(fā)生；當(dāng)酶添加量為10%，反應(yīng)4 h時(shí)，sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比達(dá)到最大值(57.36%)。分析產(chǎn)物中C52及C48的含量發(fā)現(xiàn)，五組反應(yīng)產(chǎn)物的C52含量均高于40%且C48含量低于10%。綜合以上數(shù)據(jù)分析，選擇10%的酶添加量為實(shí)驗(yàn)的最適添加量。

2.5 加水量的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在酶催化酯交換反應(yīng)體系中加入適量的水會(huì)提高酶的活性，提高反應(yīng)效率，但過(guò)量水的存在會(huì)導(dǎo)致甘油三酯發(fā)生水解，降低產(chǎn)物得率[14-17]。為了考察酶催化酯交換體系中的最適加水量，選擇實(shí)驗(yàn)條件如下：將ST52與食品級(jí)油酸以1∶10的摩爾比混合，加入占底物總質(zhì)量10%的脂肪酶 Lipozyme RM IM，并分別加入占酶重量0%、0.5%、1%、1.5%、2%的水，在56 ℃下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，并在反應(yīng)進(jìn)行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時(shí)取樣檢測(cè)。氣相分析脂肪酸組成結(jié)果如圖4所示。

圖4 加水量對(duì)棕櫚酸含量、sn-2棕櫚酸含量、C52含量、C48含量的影響

從圖中可以看出產(chǎn)物中總棕櫚酸的含量隨著反應(yīng)時(shí)間和加水量的增加而降低，并在4 h左右趨于平衡。從圖4中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物中sn-2位棕櫚酸的含量呈下降趨勢(shì)，且加水量越多，sn-2位棕櫚酸的含量下降越快。這可能是因?yàn)榧铀康脑黾訉⑻岣吒视腿ニ夥磻?yīng)發(fā)生的概率。水解反應(yīng)將生成大量的甘油二酯，從而導(dǎo)致?；D(zhuǎn)移發(fā)生的概率增大。通過(guò)計(jì)算sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加水量為酶量的1%，反應(yīng)4 h時(shí)，sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分比達(dá)到最大值(57.73%)。分析產(chǎn)物中C52及C48的含量發(fā)現(xiàn)，五組反應(yīng)產(chǎn)物的C52含量均高于40%，且C48含量低于10%。綜合以上數(shù)據(jù)分析，選擇加量占酶量1%為最適加水量。

3 結(jié)論

本文以52 ℃棕櫚硬酯為酰基受體、食品級(jí)油酸為?；w，采用Lipozyme RM IM脂肪酶為催化劑，采用一步酶法催化酸解反應(yīng)制備OPO。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到最佳反應(yīng)條件為：底物摩爾比1∶10，反應(yīng)溫度56 ℃，酶添加量10%，加水量占酶量1%，反應(yīng)時(shí)間為4 h。在最佳條件下所制備的OPO產(chǎn)品中，sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的含量為57.73%，OPO含量為45.23%，PPP含量為3.86%。

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Optimizedsynthesisof1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol-richtriacylglycerolfrompalmstearinviaenzymaticacidolysis

Li Shilei1,2, Hui Ju1,2, Chu Baijun1,2, Shang Jiayi1,2, Liu Mengtao1,2, Wang Xiangyu1,2,*

1.Nutrition & Health Research Institute, COFCO Corporation (Beijing 102209)2.Beijing Key Laboratory of Nutrition & Health and Food Safety (Beijing 102209)

1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol (OPO) is one of the most important components in human milk lipids. In previous research, it was usually synthesized through two-step methods. A novel one-step method was developed, in which the synthesis of OPO was catalyzed by Lipozyme RMIM, using palm stearin (m.p. = 52 ℃) as acyl acceptor and food grade oleic acid as acyl donor. The optimal reaction conditions investigated by single factor experiments are as follows: the molar ratio of palm stearin to oleic acid is 1∶10, the reaction temperature is 56 ℃, the dosage of enzyme 10% of the substrates (w/w)，the water content is 1% of the enzyme (w/w), and the reaction time is 4 h. GC analysis shows that the yields of OPO and tripalmitoylglycerol (PPP) are 45.23% and 3.68%, respectively, whereas the palmitic acid at sn-2 position is 57.73%.

1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol(OPO); palm stearin; synthesis process

2017-06-25

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):2017YFD0400601)；北京市科委項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：Z171100001317004)。

李世磊，男，1987年出生，工程師，主要從事油脂加工工藝研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作。

*通訊作者：王翔宇，男，1984年出生，博士，主要從事油脂加工工藝研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作。

TS 201

A

1672-5026(2017)06-009-06

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