王 羽，董文龍，張喜慶，馬紅霞，高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)對綠色氣球菌的相關(guān)性分析

王 羽，董文龍，張喜慶，馬紅霞，高云航*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，16S、23S rRNA以及16S～23S rRNA已應(yīng)用于菌種鑒定。16S～23S rRNA的基因間隔區(qū)相對于前兩者有較高的變異性，彌補了16S和23S rRNA保守性強，分化程度不夠的缺點。本研究對7株綠色氣球菌和兩株屎腸球菌擴增16S～23S rRNA基因間隔序列。通過隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)分析綠色氣球菌DNA，評價不同菌株間的克隆相關(guān)性及耐藥性。

綠色氣球菌；16S～23S rRNA；隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)

綠色氣球菌屬于條件致病菌，廣泛分布于自然界。該菌可以在免疫力低下，開放性外傷，靜脈置留管及燒傷患者的血液、尿液、腦脊液、傷口組織液等標(biāo)本中分離出，是重要的機會致病菌[1]。在細(xì)菌進(jìn)化過程中，rRNA基因的進(jìn)化相對保守，被認(rèn)為是衡量生命進(jìn)化史最理想的標(biāo)尺[2]。由于16S和23S基因在同一屬內(nèi)的不同菌株間的同源性太高，無法區(qū)分某些種系非常接近的種和型，因此必須找到其他種特異性序列[3]。國外研究已經(jīng)證實16S～23S rRNA ISR序列的進(jìn)化率要強于16S rRNA基因的10倍[4]。因此，16S～23S rRNA ISR更適合區(qū)分不同細(xì)菌的特點。1990年，由Williams等基于PCR技術(shù)之上首次推出了一種簡單、靈敏可行的遺傳標(biāo)記技術(shù)--隨機擴增多態(tài)性DNA[5]。在隨機擴增多態(tài)DNA中，用任意選擇的核苷酸序列的引物擴增基因組DNA，不同菌株的RAPD指紋可以根據(jù)PCR產(chǎn)物的數(shù)量和大小進(jìn)行比較[6]。這些擴增的DNA片段多態(tài)性反映出基因組DNA相應(yīng)區(qū)域的多態(tài)性。本研究對7株綠色氣球菌及2株屎腸球菌PCR擴增16S～23S rRNA ISR全序列，并通過隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)分析綠色氣球菌DNA，為評價不同菌株間的克隆相關(guān)性及耐藥性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 7株綠色氣球菌及2株屎腸球菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室分離保存。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。胎牛血清購自于北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所。ExTaq酶、dNTP、DNA Marker 2000、6×ExBuffer購自Takara公司。膠回收試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及PCR條件Tab 1 Primer sequences and PCR condition

a-1=35x(93oC 60s, 52oC 60s, 72oC 120s); 2=35x(94oC 30s, 40oC 45s, 72oC 45s).

以提取的DNA為模板，對基因間隔區(qū)和多態(tài)性進(jìn)行擴增。將基因間隔區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，將純化的PCR產(chǎn)物和pMD-18T連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按照試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行驗證，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 微量稀釋法藥敏試驗 用TSB液體培養(yǎng)基溶解11種抗菌藥物，并將藥物稀釋至2048 μg/mL。應(yīng)用微量稀釋在無菌96孔培養(yǎng)板對抗菌藥物進(jìn)行二倍梯度稀釋，使藥液的終濃度由512 μg/mL至0.03 μg/mL，共15個濃度梯度。將終濃度為106CFU/mL菌液 加入含有抗菌藥物的96孔板內(nèi)，并設(shè)置對照，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，進(jìn)行3次重復(fù)性試驗。試驗結(jié)果參考CLSI動物源細(xì)菌藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S-23S rRNA IGS序列擴增 以DNA為模板，擴增綠色氣球菌與屎腸球菌ISR引物，7株綠色氣球菌均在約500、600、750 bp處擴增出3條帶，兩株屎腸球菌均在約600 bp處擴增一條帶，結(jié)果如圖1。

將主條帶進(jìn)行切膠、連接、轉(zhuǎn)化并送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，7株綠色球菌菌株擴增序列與GenBank上已公布的綠色氣球菌16S～23S rRNA基因間隔序列(登錄號JN977134.1)同源性達(dá)到99%，并建立進(jìn)化樹如圖2。

M:DL2 000 DNA Marker;Ae-1-- Ae-7:綠色氣球菌;Ef-1--Ef-2:屎腸球菌M:DL2 000 DNA Marker;Ae-1-- Ae-7:Aerococcus viridians;Ef-1--Ef-2:Enterococcus faecium圖1 16S～23S rRNA ISR基因序列PCR電泳圖Fig 1 PCR electrophoresis of 16S～23S rRNA ISR gene sequence

Ae-1--Ae-7:綠色氣球菌；Ef-1, Ef-2:屎腸球菌圖2 綠色氣球菌與屎腸球菌16S～23S rRNA ISR系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 2 Phylogenetic tree of 16S～23S rRNA ISR of Aerococcus viridians and Enterococcus faecium

2.2 綠色氣球菌多態(tài)性序列擴增 綠色氣球菌RAPD 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳EB染色結(jié)果如圖3。應(yīng)用引物ERIC 1R在7株綠色氣球菌擴增出5個分子量明顯不同的特異性片段，不同菌株擴增出3類RAPD指紋。Ae-1與Ae-6有相似的指紋圖譜，Ae-2與Ae-3有相似的指紋圖譜，Ae-4、Ae-5與Ae-7有相似的指紋圖譜，證明所有分離菌株有限的變異性。

M：DL2 000 DNA Marker; Ae-1--Ae-7:綠色氣球菌M：DL2 000 DNA Marker; Ae-1-- Ae-7: Aerococus viridians圖3 綠色氣球菌RAPDA PCR電泳圖Fig 3 PCR electrophoresis of 16S～23S rRNA ISR gene sequence

2.3 綠色氣球菌藥物敏感性分析結(jié)果 7株綠色氣球菌對11種藥物的敏感性分析如表2。Ae-1與Ae-6相同耐藥譜。Ae-1與Ae-2有相似的耐藥譜。Ae-3與Ae-4有相同的耐藥譜。Ae-4、Ae-5與Ae-7相似的耐藥譜。

表2 綠色氣球菌藥物敏感性分析結(jié)果Tab 2 The drugs resistance of Aerococcus viridians

3 討論與小結(jié)

Matsuda等利用16S～23S rRNA基因的種屬特異性引物建立了大腸埃希桿菌，糞腸球菌，金黃色葡萄球菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌和綠膿假單胞菌的分析曲線，通過檢測腸道中的優(yōu)勢菌群，為腸道中共生細(xì)菌的檢測和定量提供了敏感快速的方法[8]。近年來，國外已利用16S～23S rRNA基因區(qū)間用于菌種的鑒定及種系發(fā)育研究，如本實驗根據(jù)參考文獻(xiàn)合成16S 3'末端保守序列同23S 5'端保守序列通用引物，PCR擴增16S～23S rRNA ISR全序列。16S～23S rRNA ISR序列比較結(jié)果表明7株綠色氣球菌有較高的同源性，兩株屎腸球菌有較高的同源性且單獨在一個分支上，表明16S～23S rRNA ISR序列在種間及屬間具有較高的變異性，可以明顯區(qū)分綠色氣球菌同其他菌株。

1990年Williams等建立隨機擴增多態(tài)性DNA方法[9]，RAPD分型是一種快速，可重復(fù)，高分辨率和經(jīng)濟的方法[10]。在本研究中，Ae-1與Ae-6有相似指紋又有相同耐藥譜，提示它們可能來自同一克隆菌株，但可能發(fā)生了變異。Ae-2與Ae-3有相似指紋卻表現(xiàn)出不同的耐藥譜，說明它們可能來自同一克隆株，但發(fā)生了明顯的耐藥變異。Ae-4、Ae-5與Ae-7有相似的指紋亦有相似的耐藥譜，提示它們可能來自同一克隆菌株，但可能發(fā)生了耐藥變異。Ae-3與Ae-4有相同耐藥譜卻表現(xiàn)出不同RAPD指紋，它們不太可能來自同一克隆株且發(fā)生了耐藥傳播。因此，對菌株耐藥譜的RAPD分析，可推斷其克隆相關(guān)性于耐藥譜的關(guān)系。

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DrugResistanceAnalysisofAerococcusviridiansbyRandomAmplifiedPolymorphicDNA

WANG Yu, DONG Wen-long，ZHANG Xi-qing, MA Hong-xia,GAO Yun-hang*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

GAOYun-hang,E-mail:gaoyunhang@163.com

With the development of molecular biology, the genes of 16S,23S and 16S～23S rRNA have been used in strain identification.The gene intergenic spacer(ISR) of16S～23S rRNA has a higher variability than the former two,which remedies the defects of the strong conservative and the lack of differentiations of 16S and 23S rRNA. In this study,we amplified the ISR of 7Aerococusviridianstrains and 2Enterococcusfaeciumstrains. We analysed the DNA ofAerococusviridianstrains and evaluated the clone correlations and resistances of different strains by randomly amplified polymorphic DNA(RAPD).

Aerococcusviridians; 16S～23S rRNA; RAPD

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.04

2017-03-30

A

1002-1280 (2017) 12-0019-05

S855.1+1

王 羽，碩士生，從事動物疫病防治研究。

高云航。E-mail：gaoyunhang@163.com

(編輯：侯向輝)