超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及其代謝物殘留

曾 勇，董文婷，龔 波，周 青，金 靈

(湖北省獸藥監(jiān)察所，武漢 430070)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及其代謝物殘留

曾 勇，董文婷，龔 波，周 青，金 靈

(湖北省獸藥監(jiān)察所，武漢 430070)

建立了快速測(cè)定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。禽蛋用乙腈提取后，正己烷液液萃取除脂，濃縮后超高效液相色譜分離，以乙腈和10%甲醇水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，MRM反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。結(jié)果表明在5～200 μg/L的系列濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的檢測(cè)限為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg，在2～20 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)平均回收率為60%～100%，精密度小于20%。該方法方便快捷、定性準(zhǔn)確，適于禽蛋中的氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺藥物殘留檢測(cè)。

禽蛋；氯霉素類藥物；殘留；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

禽蛋是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾膬?yōu)質(zhì)食品，特別是雞蛋的蛋白質(zhì)含量高，而且富含膽固醇，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但蛋雞飼養(yǎng)密度大，多發(fā)疾病，在疾病預(yù)防和治療過(guò)程中，由于獸醫(yī)臨床不遵守休藥期使用，極易造成雞蛋中的藥物殘留，這些殘留會(huì)直接損害消費(fèi)者的健康，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性等等。氯霉素類藥物屬于廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有抑制作用，氟苯尼考是動(dòng)物專用抗菌藥，其結(jié)構(gòu)和氯霉素相似，在安全性和有效性方面比氯霉素有明顯優(yōu)勢(shì)，其主要代謝產(chǎn)物為氟苯尼考胺[1]。農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)規(guī)定氯霉素為禁止使用的藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出，氟苯尼考為產(chǎn)蛋期禁用藥物，而我國(guó)目前國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中只涉及水產(chǎn)品、蜂蜜以及動(dòng)物肌肉組織中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺單個(gè)或兩種藥物殘留檢測(cè)方法[2-4]，還未建立蛋品中同時(shí)檢測(cè)氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺殘留檢測(cè)方法。本方法擬建立禽蛋中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以期為禽蛋中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺藥物殘留的監(jiān)控提供靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)獸藥殘留監(jiān)控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源Acquity UPLC-Quattro Premier XE 質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司；AE260電子天平，Mettler Toledo 公司；冷凍高速離心機(jī)，Sigma公司；渦旋混合器；振蕩器；氮吹儀。氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺對(duì)照品均來(lái)自德國(guó)DR公司；乙腈為色譜純；甲醇為色譜純；正己烷為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺對(duì)照品約10 mg置于100 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，此溶液濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確量取1.00 mL氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻即得1 μg/mL混合工作液。

1.3 樣品處理 稱取5 g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL塑料離心管，加入10 mL乙腈，于渦旋混合器上渦旋1 min，水平振蕩5 min，以10000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，樣品殘?jiān)偌尤?0 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。提取液用10 mL正己烷渦旋混勻，以10000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，下層再用正己烷重復(fù)操作一次，取下層乙腈在40 ℃水浴中氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1 mL水溶解殘?jiān)瑴u旋1 min，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，以12000 r/min離心5 min，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2 UPLC-MS/MS 分析

2.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：waters Xbrige C18柱(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)；流動(dòng)相：A：乙腈，B：10%的甲醇水溶液，梯度洗脫：0～3 min，5%A～40%A，3～4 min，40%A～95%A，4～6 min，95%A～5%A，流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 ESI(+)；掃描方式:正離子掃描(氟苯尼考胺)和負(fù)離子掃描(氟苯尼考和氯霉素)；毛細(xì)管電壓：3.0 kv；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑流量：800 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM采集模式)。各種藥物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)和碰撞能量見表1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取一定量的氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白樣品提取液分別配成濃度為5，10，20，50，100，200 μg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。每個(gè)濃度重復(fù)三次，將測(cè)得的峰面積與對(duì)應(yīng)濃度擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表2)。

2.4 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度 采用空白試樣中添加目標(biāo)化合物的方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到特征離子色譜峰信噪比大于或等于3的最低濃度為0.5 μg/kg即方法的檢測(cè)限。信噪比大于或等10的最低濃度為2.0 μg/kg即方法的定量限?？瞻浊莸爸刑砑痈魉幬锖蟮玫降奶卣麟x子質(zhì)量色譜圖如圖1所示。

表1 定性離子對(duì)、定量離子對(duì)和碰撞能量Tab 1 Qualitative ion pair,quantification ion pair and Collision energy

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Tab 2 Standard curve equation

圖1 空白雞蛋中添加2μg/kg氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 1 Characteristic ion mass chromatogram of chloramphenicol,florfenicol and florfenicol amine 2μg/kg added in blank eggs

在空白禽蛋中添加2.0、4.0、20.0 μg/kg三個(gè)不同濃度的藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行5個(gè)平行試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)行3次，雞蛋結(jié)果見表3，鴨蛋結(jié)果見表4。本方法在2～20 μg/kg濃度范圍內(nèi)，添加濃度的回收率為60%～100%。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。

表3 雞蛋中添加藥物回收率及精密度測(cè)定結(jié)果Tab 3 Recovery rate and precision of the drugs added in eggs

表4 鴨蛋中添加藥物回收率及精密度測(cè)定結(jié)果Tab 4 Recovery rate and precision of the drugs added in duck eggs

3 討論與小結(jié)

3.1 提取與凈化 氯霉素、氟苯尼考都是弱極性化合物，而氟苯尼考胺屬于極性化合物，且它們都屬于弱堿性化合物，極易溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。國(guó)內(nèi)外關(guān)于在動(dòng)物組織樣品中同時(shí)提取氯霉素、氟苯尼考以及氟苯尼考胺大多采用堿化乙酸乙酯。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、堿性乙酸乙酯、甲醇三種試劑的回收率情況，甲醇回收率較低，禽蛋中加入堿性乙酸乙酯后樣品基質(zhì)變成果凍狀，無(wú)法充分提取。用乙腈能有效提取三種藥物，再用正己烷去除脂肪等雜質(zhì)，省去了固相萃取步驟，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮時(shí)用氮?dú)獯蹈扇〈?，減少了交叉污染的機(jī)會(huì)。

3.2 流動(dòng)相條件 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乙腈和10%甲醇水作為流動(dòng)相，各組分均能較好分離，并且峰形較好，在質(zhì)譜上也有較強(qiáng)的響應(yīng)。而乙腈和0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)于正離子模式采集的氟苯尼考胺的信號(hào)有明顯增強(qiáng)，因?yàn)榧姿釋?duì)分析物容易質(zhì)子化而帶上正電荷，然而對(duì)于氯霉素和氟苯尼考的負(fù)離子采集模式會(huì)受到抑制[5]。

3.3 基質(zhì)效應(yīng) 對(duì)氯霉素類物質(zhì)殘留檢測(cè)文獻(xiàn)中采用的是內(nèi)標(biāo)法，本文采用了配制基質(zhì)曲線法外標(biāo)定量，用基質(zhì)空白溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，從而降低基質(zhì)效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也考察了基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用空白雞蛋樣品按照1.3項(xiàng)的提取方法制得陰性空白基質(zhì)樣液(B)，然后用空白試劑水(A)和空白基質(zhì)樣液(B)，分別配制2.3項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液A和標(biāo)準(zhǔn)溶液B，進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表5?；|(zhì)效應(yīng)ME可以用基質(zhì)曲線斜率/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率×100%來(lái)進(jìn)行計(jì)算，一般認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)ME在85%～115%之間不存在明顯基質(zhì)效應(yīng)，從表5可以看出，氯霉素和氟苯尼考兩種藥物在乙腈提取制得的空白基質(zhì)樣液無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

表5 氯霉素類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程和基質(zhì)效應(yīng)(ME)Tab 5 Linear equations and matrix effect of chloramphenicol standard solution and matrix standard solution(ME)

3.4 方法的定量限 在方法研究中，氯霉素濃度在0.3 μg/kg時(shí)，其S/N為23.6，說(shuō)明降低氯霉素的定量限空間很大，后續(xù)可進(jìn)一步研究，降低氯霉素的定量限。

本研究建立了禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS分析方法，通過(guò)對(duì)儀器色譜條件和質(zhì)譜條件各項(xiàng)參數(shù)的調(diào)諧以及對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，使得方法的靈敏度、精確度均能滿足獸藥殘留分析。本方法具有操作步驟少、有機(jī)溶劑消耗少、測(cè)定周期短等優(yōu)點(diǎn)，而且能同時(shí)對(duì)氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺三種藥物進(jìn)行多殘留檢測(cè)。

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RapidDeterminationofChloramphenicol，F(xiàn)lorfenicolandItsMetabolitesinPoultryEggsbyUPLC-MS/MS

ZENG Yong ,DONG Wen-ting,GONG Bo, ZHOU Qin, JIN Ling

(HubeiInstituteofVeterinaryDrugControl,Wuhan430070，China)

A UPLC-MS/MS method was developed and established to rapidly determine chloramphenicol, florfenicol and florfenicol-amine in poultry eggs. The eggs were extracted with acetonitrile and then separated by n-hexane liquid. After enrichment, the samples were separated by UPLC, elutedwith acetonitrile and 10% methanol as the mobile phase and the MRM reaction was monitored. The results showed that there was a good linearity in the range of 5～200 μg/L ,and the correlation coefficients were more than 0.999. The detection limit of the chloramphenicol, florfenicol and florfenicol-amine was 0.5 μg/kg, and the limit of quantification was 2 μg/kg. The average recoveries were 60%～100% in the range of from 2 μg/kg to 20 μg/kg, and the precision was less than 20%. The method was convenient, rapid, accurate and it was suitable for the detection of chloramphenicol in poultry eggs.

poultry eggs; chloramphenicol; residues; UPLC-MS/MS

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.08

2017-06-20

A

1002-1280 (2017) 12-0042-05

S859.84

曾 勇，農(nóng)業(yè)推廣研究員，從事獸藥殘留分析方法研究工作。E-mail: zengyong633@126.com

(編輯：侯向輝)