鄭艷陽(yáng),曹鳳嬌,明 迪,母 丹,向 華

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

SarA調(diào)控金黃色葡萄球菌生物被膜形成的研究進(jìn)展

鄭艷陽(yáng)1,曹鳳嬌1,明 迪2,母 丹2,向 華1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

金黃色葡萄球菌生物被膜的形成是一個(gè)多基因和多因子共同調(diào)控的過(guò)程。葡萄球菌屬輔助調(diào)節(jié)子SarA是金黃色葡萄球菌主要的毒力基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，能直接或間接調(diào)控多種生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)。本文對(duì)SarA的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控生物被膜形成的機(jī)制作一綜述，以期為深入研究金黃色葡萄球菌的致病機(jī)理和開(kāi)發(fā)新的抗生物膜感染策略提供參考。

金黃色葡萄球菌；SarA；生物被膜

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，以下簡(jiǎn)稱金葡菌)是引起人類和動(dòng)物臨床感染的重要病原體之一[1]，感染金葡菌后會(huì)引發(fā)一系列感染，從輕度的皮膚感染到嚴(yán)重的全身感染[2]。金葡菌易形成生物被膜(biofilm，BF)，這是金葡菌引發(fā)慢性感染的主要原因[3]，它的形成與金葡菌細(xì)胞外基質(zhì)包括多糖細(xì)胞間黏附素(extracellular polysaccharide intercellular adhesion，PIA)，蛋白質(zhì)和胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)密切相關(guān)。葡萄球菌屬輔助調(diào)節(jié)子SarA是金葡菌主要的毒力基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。研究表明，不論是在體內(nèi)或是在體外條件下，SarA均能通過(guò)介導(dǎo)各種生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控金葡菌BF的形成[4]。本文將對(duì)SarA的結(jié)構(gòu)以及SarA調(diào)控生物被膜形成相關(guān)因子表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行全面的綜述，從而為尋找新型有效的抗菌膜劑提供新的思路和理論依據(jù)。

1 SarA的結(jié)構(gòu)

SarA是由sarA基因座編碼的大小為14.7 kDa的DNA結(jié)合蛋白，它能與靶基因啟動(dòng)子富含A/T保守序列的區(qū)域結(jié)合形成二聚體，也能通過(guò)下游基因作用于其他調(diào)節(jié)子(例如與agr啟動(dòng)子結(jié)合)直接或間接影響目的基因的轉(zhuǎn)錄[5-6]。sarA基因座由1.2 kb個(gè)堿基組成，包含三個(gè)重疊的轉(zhuǎn)錄單位，分別是sarA(0.58 kb)、sarC(0.84 kb)、sarB(1.15 kb)，每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位分別由P1、P2、P3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)[5]。

圖1 Apo-SarA晶體結(jié)構(gòu)[7]Fig 1 Crystal structures of Apo-SarA[7]

圖2 Apo-SarA晶體結(jié)構(gòu)[8]Fig 2 Crystal structures of Apo-SarA[8]

1.2 DNA-SarA的結(jié)構(gòu) 翼狀螺旋蛋白家族成員均有保守的DNA識(shí)別結(jié)合基序，SarA與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域包括HTH基序(α3α4)和由β-發(fā)夾轉(zhuǎn)角螺旋(β2β3)組成的翼狀結(jié)構(gòu)域(W1)[6]。Liu等研究提出SarA與DNA相互作用的方式與其翼狀螺旋蛋白家族成員SarR相似，即HTH基序與DNA大溝相互作用，翼狀結(jié)構(gòu)域與DNA小溝相互作用[8](圖3)。SarA突變蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析圖表明，翼狀結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基R84和R90對(duì)SarA與目標(biāo)DNA(160-bp spa啟動(dòng)子片段)的相互作用至關(guān)重要，并且這兩個(gè)氨基酸殘基在SarA蛋白家族中高度保守[8](圖4)。翼狀結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基D88和E89，金屬結(jié)合口袋氨基酸殘基D8和E11以及半胱氨酸殘基C9均對(duì)SarA活性起到一定的作用，可見(jiàn)翼狀結(jié)構(gòu)域是SarA的關(guān)鍵活性部位[8]。

圖3 SarA-DNA晶體結(jié)構(gòu)Fig 3 Crystal structures of SarA-DNA complex

圖4 SarA突變蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig 4 SDS-PAGE analysis of mutant SarA proteins expression

2 SarA調(diào)控金葡菌生物被膜形成的機(jī)制

SarA是金葡菌的主要毒力因子表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，它能促進(jìn)或抑制金葡菌許多毒力基因的表達(dá)，基因芯片分析發(fā)現(xiàn)SarA至少會(huì)影響120個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。其中，SarA可以促進(jìn)agr的表達(dá)，而agr會(huì)降低金葡菌形成BF的能力，推測(cè)若sarA突變，金葡菌BF形成能力會(huì)增強(qiáng)[9]。但Valle等研究發(fā)現(xiàn)，sarA突變卻造成BF形成能力減弱，這可能與SarA調(diào)控多種生物被膜相關(guān)基因有關(guān)。例如SarA突變，會(huì)引起胞外蛋白酶和核酸酶的相關(guān)表達(dá)增加，它們會(huì)削弱BF形成的能力[10]。并且研究還發(fā)現(xiàn)agr突變株和agr野生株形成生物被膜的能力相同，說(shuō)明SarA是以agr非依賴途徑調(diào)控金葡菌BF的形成[10]。金葡菌BF形成過(guò)程中存在ica依賴途徑和ica非依賴途徑[11]。

2.1 ica依賴途徑 PIA是金葡菌BF形成過(guò)程中的重要因子，主要在BF形成的黏附和繁殖階段發(fā)揮作用。PIA是由胞間黏附素(intercellular adhesion，ica)操縱子icaABCD表達(dá)產(chǎn)物共同催化合成[9]。大部分的金葡菌都攜帶ica操縱子，但ica操縱子對(duì)金葡菌生物被膜形成所起的作用很復(fù)雜，并且存在菌株和環(huán)境依賴性[12]。

Valle等研究首次發(fā)現(xiàn)金葡菌sarA突變株生物被膜表型缺失的現(xiàn)象，他們指出sarA突變會(huì)顯著減少ica和PIA的表達(dá)量，導(dǎo)致細(xì)菌無(wú)法形成生物被膜[10]。然而研究并未指出SarA可否與ica操縱子的啟動(dòng)子結(jié)合。而Tormo等研究證實(shí)了SarA能與ica操縱子的啟動(dòng)子結(jié)合，他們發(fā)現(xiàn)SarA與icaR-icaA啟動(dòng)子序列之間的親和力高，啟動(dòng)子序列之間存在多個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)，SarA易與這些DNA位點(diǎn)結(jié)合，從而促進(jìn)ica操縱子的表達(dá)[13]。Cerca等研究還發(fā)現(xiàn)SarA可以上調(diào)icaR的表達(dá)，IcaR是位于ica操縱子上游的調(diào)控基因，IcaR對(duì)ica操縱子的表達(dá)有抑制作用。但研究表明，與表皮葡萄球菌不同，金葡菌中IcaR對(duì)ica操縱子的表達(dá)基本沒(méi)有影響[14]。

除此之外，有研究表明磷酸化/去磷酸化與SarA活性和BF的形成密切相關(guān)。Didier等研究發(fā)現(xiàn)金葡菌絲氨酸激酶StK1/PknB和蘇氨酸激酶SA0077對(duì)SarA有磷酸化作用。SarA經(jīng)StK1/PknB磷酸化后，能增強(qiáng)與某些啟動(dòng)子序列的親和力[15]。Tamber等的研究提出磷酸化后的SarA可能會(huì)顯著影響ica操縱子的表達(dá)，但具體機(jī)制尚不清楚[16]。

2.2 ica非依賴途徑 icaADBC操縱子和PIA固然對(duì)金葡菌BF的形成至關(guān)重要，但近來(lái)有研究提出了ica非依賴金葡菌BF形成機(jī)制[17]。Beenken等研究發(fā)現(xiàn)剔除人源金葡菌臨床分離株UASM-1 的ica基因，對(duì)生物被膜的形成并沒(méi)有影響，而突變sarA后則會(huì)削弱生物被膜的形成能力[17]。此外有研究發(fā)現(xiàn)sarA突變會(huì)消除耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)形成生物被膜的能力，而MRSA主要是以蛋白質(zhì)介導(dǎo)的ica非依賴途徑形成生物被膜[18-19]。因此，以上數(shù)據(jù)表明SarA也能調(diào)控ica非依賴生物被膜的形成。

2.2.1 蛋白質(zhì)依賴途徑 在ica非依賴金葡菌BF形成途徑中，主要是蛋白質(zhì)和eDNA等發(fā)揮作用，它們均是細(xì)菌BF基質(zhì)的重要成分。在金葡菌中，BF的形成與某些細(xì)胞壁錨定蛋白有關(guān)，包括表面蛋白C和G(surface protein C and G，SasC和SasG)、凝集因子A/B(clumping factor A/B，ClfA/ClfB)、絲氨酸-天冬氨酸重復(fù)蛋白(serine aspartate repeat proteins，SdrC、SdrD和SdrE)，生物膜相關(guān)蛋白(biofilm associated protein，Bap)，表面蛋白A (surface protein A，SpA)和纖連蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin-binding proteins ，F(xiàn)nBPA和FnBPB)[20]。研究表明這些葡萄球菌屬表面蛋白可以在ica非依賴BF形成的初始黏附和聚集階段中發(fā)揮作用[21]。J.Penades和I.Lasa研究團(tuán)隊(duì)最先闡明了ica非依賴的生物被膜形成機(jī)制，他們證實(shí)了Bap在奶牛乳房炎金葡菌分離株V329 BF形成的初始黏附和聚集階段中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)突變V329的ica操縱子，并不會(huì)影響B(tài)F的形成。另外Totonda等研究分析了SarA對(duì)Bap表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)SarA以agr非依賴途徑上調(diào)了bap的表達(dá)，SarA可以與bap的啟動(dòng)子結(jié)合，SarA是bap表達(dá)的活化劑[23]。他們構(gòu)建的sarA突變株JP62和JP65均不能形成生物被膜，而將攜帶sarA的重組質(zhì)粒導(dǎo)入JP66和JP69中后，Bap重新表達(dá)，并且均能形成生物被膜，表明SarA可以恢復(fù)Bap依賴的生物被膜形成能力[23]。

研究還發(fā)現(xiàn)，胞外蛋白酶在蛋白質(zhì)依賴的生物被膜形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]。SarA可以抑制胞外蛋白酶(extracellular protease)的活性。并且有研究表明，在SarA調(diào)控生物被膜形成的機(jī)制中，相比于PIA依賴機(jī)制，胞外蛋白酶介導(dǎo)機(jī)制更為重要，而且在此過(guò)程中，SarA不依賴agr途徑[4]。Zielinska等研究發(fā)現(xiàn)在金葡菌sarA突變會(huì)導(dǎo)致胞外蛋白酶包括金屬蛋白酶(aureolysin，Aur)，絲氨酸蛋白酶(serine protease，SspA和SplA-F)，半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease ，ScpA/ SspB)分泌增加，這些金葡菌胞外蛋白酶均能限制BF形成，其中Aur影響最大[25-26]。sarA突變后，胞外蛋白酶分泌增加，這會(huì)導(dǎo)致超過(guò)250多種金葡菌蛋白質(zhì)包括FnBPA，SpA，α-毒素以及酚可溶性調(diào)控蛋白的表達(dá)減少，這些蛋白與金葡菌的多種致病機(jī)理有關(guān)包括BF形成[25]。

FnBPA和FnBPB是金葡菌與纖維蛋白原結(jié)合的主要蛋白，它們能促進(jìn)細(xì)菌定殖到宿主組織，完成BF形成的初始黏附過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，MRSA菌株的生物被膜形成能力主要與表面蛋白，特別是FnBPA和FnBPB密切相關(guān)。Loughran等的研究發(fā)現(xiàn)aur可以抑制MRSA和MSSA形成生物被膜的能力[26]。他們還構(gòu)建了MRSA sarA突變株，并且分別構(gòu)建了同源的四株雙重突變株sarA/aur、sarA/sspAB、sarA/sspB、sarA/scpA，發(fā)現(xiàn)SarA可以限制這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少其對(duì)應(yīng)編碼的胞外蛋白酶的分泌，降低了生物被膜形成相關(guān)蛋白的解聚，繼而促進(jìn)了BF的形成[27]。他們還發(fā)現(xiàn)突變sspABC操縱子可以恢復(fù)sarA突變株FnBPA的表達(dá)，而突變編碼aur的基因可以恢復(fù)SpA，α-毒素以及酚可溶性調(diào)控蛋白的表達(dá)[26]。但SspA需要SspB的激活，Aur需要SspA的激活，所以Aur可能是間接地影響這些毒力因子的表達(dá)[27]。然而研究發(fā)現(xiàn)，突變sarA突變株sspABC操縱子并沒(méi)有恢復(fù)SpA，α-毒素以及酚可溶性調(diào)控蛋白的表達(dá)，說(shuō)明aur自身會(huì)影響這些毒力因子的表達(dá)[26]。

除此之外有研究發(fā)現(xiàn)，在Newman菌株中，SarA可以通過(guò)與SaePQRS協(xié)同合作來(lái)抑制蛋白酶的合成，SarA能提高SaePQRS的活性，而SaePQRS能抑制胞外蛋白酶的分泌，使得生物被膜表面相關(guān)蛋白如FnBPA分泌量增加，從而促進(jìn)了生物被膜的形成。但目前對(duì)于SaePQRS抑制蛋白酶分泌的機(jī)制還尚不清楚[28]。他們還發(fā)現(xiàn)往sarA突變株添加全局蛋白酶抑制劑后，F(xiàn)nBPs水平提高了6倍，而加入半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64并沒(méi)有影響FnBPs的水平，表明SarA不是通過(guò)影響SspB和ScpA的分泌來(lái)影響FnBPs的水平[29]。研究發(fā)現(xiàn)ssp或aur活性喪失，會(huì)導(dǎo)致10到20倍金葡菌sarA突變株SpA水平的增加[29]。

2.2.2 eDNA依賴途徑 eDNA在ica非依賴金葡菌生物被膜形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它主要影響生物被膜形成的早期黏附階段和成熟階段[29-31]。研究發(fā)現(xiàn)，用DNaseI 處理成熟的生物被膜，生物被膜會(huì)溶解[30]。此外，eDNA在生物被膜中的水平會(huì)受到耐熱核酸酶(nuclease，nuc)的調(diào)控，而許多研究表明SarA 會(huì)下調(diào)nuc的表達(dá)[32-33]。

Tsang等研究構(gòu)建了UAMS-1 nuc突變株和nuc/sarA雙重突變株來(lái)分析它們對(duì)生物被膜形成的影響。研究發(fā)現(xiàn)sarA突變，nuc的表達(dá)水平提高，而突變sarA突變株的nuc后，便無(wú)法合成核酸酶[32]。他們還發(fā)現(xiàn)與sarA突變株相比，nuc/sarA雙重突變株形成生物被膜的能力顯著提高，但生物被膜數(shù)量并未恢復(fù)到野生水平，而往nuc/sarA雙重突變株中添加攜帶sarA的重組質(zhì)粒后，生物被膜數(shù)量恢復(fù)到正常水平[32]。這些數(shù)據(jù)表明UAMS-1 sarA突變株生物被膜表型缺失與核酸酶表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，但在此過(guò)程中，SarA也參與調(diào)控了其他生物被膜形成相關(guān)因子的表達(dá)[32]。

Dengler等對(duì)報(bào)道過(guò)能影響eDNA合成的一些基因進(jìn)行了突變，包括自溶素基因(Alt、Aaa)、CidA、LrgAB以及SarA。其中，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)sarA突變，eDNA的合成明顯減少，同時(shí)生物被膜數(shù)量也顯著減少[33]。除此之外，Atwood等研究發(fā)現(xiàn)在耐甲氧西林金葡菌LAC中sarA突變反而會(huì)抑制核酸酶的活性，但消除sarA突變株合成胞外蛋白酶能力后便能恢復(fù)其核酸酶的活性，說(shuō)明SarA是通過(guò)降低胞外蛋白酶的分泌間接影響核酸酶的活性[34]。更重要的是，消除sarA突變株的蛋白酶后，盡管核酸酶活性增強(qiáng)，生物被膜數(shù)量仍會(huì)增加。這些數(shù)據(jù)表明，在耐甲氧西林金葡菌LAC 中，相比核酸酶，胞外蛋白酶對(duì)sarA突變株生物被膜缺失表型起到更重要的作用[34]?？梢?jiàn)SarA調(diào)控eDNA依賴的生物被膜形成具有菌株特異性。

3 結(jié) 語(yǔ)

金葡菌生物被膜形成是一個(gè)多基因和多因子共同調(diào)控的過(guò)程。SarA作為金葡菌主要的毒力基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，參與調(diào)控了多種生物被膜形成相關(guān)因子的表達(dá)。PIA，蛋白質(zhì)，eDNA作為金葡菌生物被膜的重要組成成分，自然是SarA調(diào)控金葡菌生物被膜形成的關(guān)鍵靶點(diǎn)。由于菌株特異性和環(huán)境依賴性，SarA參與調(diào)控不同菌株生物被膜形成的機(jī)制不盡相同。本文通過(guò)總結(jié)前人的研究結(jié)果，概述了SarA調(diào)控金葡菌生物被膜形成的三條途徑，為日后以SarA作為有效靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新型金葡菌BF感染抑制劑提供了重要的參考。但目前針對(duì)SarA靶向抑制劑的研究并不多，因此，醫(yī)學(xué)工作者今后應(yīng)將工作重點(diǎn)放在尋找出對(duì)SarA活性有明顯抑制作用的藥物。近來(lái)許多研究表明，中藥單獨(dú)或者聯(lián)合其他傳統(tǒng)抗生素能夠有效破壞金葡菌成熟生物被膜結(jié)構(gòu)，從而使得藥物成功進(jìn)入膜內(nèi)殺滅細(xì)菌。生物被膜的形成是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一，由于抗菌藥物的不合理使用，日益加劇了細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性。中藥不僅具有天然的活性成分，并且具備來(lái)源廣泛，安全性能高，毒副作用小，作用靶點(diǎn)不單一，不易產(chǎn)生耐藥性等多種優(yōu)點(diǎn)，因此，篩選中藥化合物作為SarA靶向抑制劑可行性很大，同時(shí)也符合綠色抗生素市場(chǎng)的需求?？偠灾?，隨著金葡菌生物被膜形成機(jī)制研究的深入發(fā)展和抗菌膜劑的不斷開(kāi)發(fā)，人類將能更好地控制金葡菌感染。

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ProgressinStudyofImpactofSarAonBiofilmFormationbyStaphylococcusaureus

ZHENG Yan-yang1, CAO Feng-jiao1, MING Di2, MU Dan2, XIANG Hua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China;2.CollegeofAnimalScience，JilinUniversity，Changchun130062，China)

Staphylococcusaureusbiofilm mode of growth is coherently regulated by multiple genes and factors. Staphylococcal accessory regulator SarA is one of the major regulatory systems which mediate virulence genes expression inS.aureus. Several biofilm-associated genes expression is controled by SarA either in a direct or indirect way. This article conducted a general review regarding the structures of SarA and its regulatory mechnisams on biofilm formation byStaphylococcusaureus. These findings provide an important reference for the pathogenesis ofS.aureusand the development of new strategies applied to eradicate biofilm-associated infections.

Staphylococcusaureus; SarA; biofilm

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.12

2017-05-27

A

1002-1280 (2017) 12-0062-07

S852.61

吉林省教育廳"十三五"科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字[2016]第194號(hào))

鄭艷陽(yáng)，碩士研究生，從事動(dòng)物藥理學(xué)研究。

向 華。E-mail：xianghua@126.com

(編輯：侯向輝)