葛穎華 周 萃 鄔 科 何國濃

浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315000

超聲法提取紫皮石斛多糖工藝的研究

葛穎華 周 萃 鄔 科 何國濃#

浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315000

紫皮石斛 超聲提取 苯酚-硫酸法 多糖

紫皮石斛為雙子葉植物藥蘭科植物齒瓣石斛Dendrobium devonianum Paxt.的干燥莖，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳、益腎明目的功效，主要用于熱病傷津或胃陰不足之舌干口渴、陰虛津虧之虛熱不退等癥，分布于我國的云南、廣東、廣西、貴州等省[1-2]。石斛的化學(xué)成分主要為多糖、生物堿、菲類、聯(lián)芐類［3-4］，其中多糖是其發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。2015年版《中國藥典》收載的石斛主流品種有金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛和鐵皮石斛等，其中以鐵皮石斛功效最佳，研究表明紫皮石斛富含黏液，化學(xué)成分及藥理作用類似鐵皮石斛，主要活性成分多糖的含量也可與鐵皮石斛相媲美，且其價格相對鐵皮石斛便宜較多，可謂物美價廉［5-6］。

目前，關(guān)于紫皮石斛多糖類成分的提取方法研究較少，且存在提取時間長、操作復(fù)雜的缺點。本研究通過對超聲法與回流提取法的比較發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，超聲法的提取效率可達(dá)到回流提取的80%以上，并通過正交試驗系統(tǒng)考察了超聲法的提取條件，最終確定了超聲法提取紫皮石斛多糖的最佳提取工藝，為紫皮石斛多糖含量的快速分析提供了參考。

1 材料與儀器

1.1 材料：紫皮石斛采自浙江省樂清縣，經(jīng)寧波市中醫(yī)院王杰主任中藥師鑒定為真品，60℃下烘干并過80目篩；葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所）；水為純化水，苯酚、硫酸均為分析純。

1.2 儀器：AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，202-2型干燥箱（浙江諸暨電熱儀器廠），HH.S21-4S電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），KQ-300GVDV型三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），722S可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，得1.137mg/ml的葡萄糖對照品母液。精密量取2ml葡萄糖對照品母液至25ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制成90.96μg/ml的溶液，作為對照品溶液，備用。

2.2 線性關(guān)系考察：精密量取葡萄糖對照品溶液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml置10ml具塞試管中，加水至1.0ml，精密加入5%苯酚溶液1ml（臨用前現(xiàn)配制），搖勻，再精密加入硫酸5ml，搖勻，置沸水浴中加熱20min，取出，放入冰水浴中冷卻5min，以相應(yīng)的試劑為空白，在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.0745X+0.044，r=0.9938。結(jié)果表明多糖在0.65～12.99μg/ml。結(jié)果見圖1。

2.3 紫外分光光度法測定紫皮石斛多糖含量：取紫皮石斛粉末（80目）約0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定體積的水，稱定重量，超聲提?。üβ?50W，頻率20kHz）一定時間后，取出，冷卻，再稱定重量，用水補足減失重量，濾過。精密量取續(xù)濾液1ml，至25ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，取1ml置10ml具塞試管中，按2.2項“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波長下測定吸光度并計算其含量。

2.4 提取方法的選擇：方法一：取紫皮石斛藥材粉末（過80目篩）約0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水100ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用水補足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

方法二：取紫皮石斛藥材粉末（過80目篩）約0.15g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入水100ml，110℃加熱回流，提取1.5h，濾過，取續(xù)濾液，即得。

兩種提取方法多糖含量測定及比較：分別精密量取上述兩種提取溶液各1ml，至25ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，取1ml置10ml具塞試管中，按2.2項“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波長下測定吸光度并計算其含量。結(jié)果見表1。

表1 提取方法考察表

結(jié)果表明，在取樣量及提取溶劑相同的條件下，紫皮石斛藥材粉末經(jīng)超聲及回流提取，多糖含量都相對較高，但采用超聲提取僅30min就可達(dá)到回流提取效率的80%以上，且操作簡便，故選用超聲法并系統(tǒng)考察其提取條件。

2.5 正交試驗：采取正交試驗設(shè)計，選用A（超聲時間）、B（超聲次數(shù)）、C（提取倍量）、D（提取溫度）4個因素，每個因素3個水平對超聲提取法進行考察，用L9（34）正交表做實驗設(shè)計。結(jié)果見表2。以紫皮石斛中多糖的含量為評價指標(biāo)進行直觀分析、方差分析。結(jié)果見表3、表4。

表2 正交因素水平表

表3 紫皮石斛多糖正交試驗數(shù)據(jù)及直觀分析表

表4 紫皮石斛多糖正交試驗方差分析表

表3結(jié)果表明，D（提取溫度）對提取率的影響最為顯著（P＜0.05），A（超聲時間）、B（超聲次數(shù)）、C（提取倍量）對提取率的影響相對較小。綜合評分?jǐn)?shù)據(jù)的極差大小顯示各因素主次為D＞A＞C＞B。D（提取溫度）中，均值1＞均值2＞均值3，說明紫皮石斛多糖在超聲提取條件下，在提取溫度達(dá)到30℃時，多糖溶出效果最好，因此最佳提取條件篩選為D1A3C2B2；結(jié)合方差分析結(jié)果，D（提取溫度）對提取效果有極顯著意義，A（超聲時間）對提取效果也呈現(xiàn)一定的顯著性，考慮到各因素影響主次，結(jié)合能效，最終確定最佳工藝條件為D1A3C1B1，即提取溫度30℃，超聲提取40min，超聲1次，提取倍量為200倍時，多糖提取效果最好。

2.6 方法可行性試驗：具體分述如下。

2.6.1 精密度試驗：精密吸取葡萄糖對照品溶液6份，置10ml具塞試管中，加水至1.0ml，按2.2項“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波長下測定吸光度并計算其含量，RSD值為2.72%，小于3%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗結(jié)果

2.6.2 重復(fù)性試驗：取同一批次的紫皮石斛樣品6份，每份約0.15g，精密稱定。按篩選出的條件進行超聲提取，按2.3項下方法操作，測定吸光度并計算每份樣品中的多糖含量，RSD值為2.87%，小于3%，表明方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表6。

2.6.3 加樣回收率試驗：精密量取已知含量的樣品溶液6份（多糖含量43.81%），每份0.5ml，置10ml具塞試管中，精密加入葡萄糖對照品溶液0.4ml，加水補至1ml，按2.2項“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波長下測定吸光度計算加樣回收率。見表7。

表6 重復(fù)性試驗結(jié)果

表7 加樣回收率試驗結(jié)果

2.6.4 穩(wěn)定性試驗：取紫皮石斛樣品約0.15g，精密稱定。按篩選出的條件進行超聲提取，按2.3項下方法操作，提取后樣品于常溫下放置10min、0.5h、1h、2h、4h、6h后，分別測定吸光度并計算每份樣品中的多糖含量，RSD值為2.32%，小于3%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表8。

表8 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3 小結(jié)

本研究采取超聲法和回流提取法比較了不同提取方法對石斛多糖含量的影響，在取樣量及提取溶劑相同的條件下，采用超聲提取僅30min就可達(dá)到回流提取效率的80%以上，且操作簡便，故選用超聲法并系統(tǒng)考察其提取條件。以超聲時間、超聲次數(shù)、提取倍量、提取溫度4個因素，每個因素3個水平對超聲提取法進行考察，結(jié)果顯示，提取溫度30℃，超聲提取40min，超聲1次、提取倍量為200倍時，多糖提取效果最好，且該方法重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好，可作為提取紫皮石斛多糖的工藝。

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# 通訊作者：何國濃，E-mail：nbszyykjk@163.com

2017-06-07