家蠅3種絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)基因的克隆、序列分析及表達(dá)模式

魏川川，修江帆，胡 亞，尚小麗，張迎春，吳建偉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550004)

家蠅3種絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)基因的克隆、序列分析及表達(dá)模式

魏川川2，修江帆1*，胡 亞1，尚小麗1，張迎春1，吳建偉1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550004)

對(duì)家蠅3種絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin基因SP2、SP13和SP16進(jìn)行克隆、序列分析和時(shí)空表達(dá)模式檢測(cè)。運(yùn)用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASy)和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)等有關(guān)的生物信息學(xué)分析工具，預(yù)測(cè)和分析3條Serpin基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。以RPS18(核糖體S18蛋白)為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術(shù)檢測(cè)3條Serpin基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期，以及家蠅3齡幼蟲中脂肪體、唾液腺、中腸、馬氏管和體壁的表達(dá)特征。SP2、SP13、SP16基因序列的開放閱讀框ORF全長(zhǎng)分別為1191 bp、1137 bp和1212 bp，分別編碼含396、378和403個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其理論分子量分別為45315.3 Da、43701.5 Da和45011.5 Da，等電點(diǎn)分別為9.01、5.98和6.04，蛋白質(zhì)的N端都含有一段信號(hào)肽，并具有Serpin基因的保守結(jié)構(gòu)域，屬于Serpin家族。SP2和SP16在蛋白質(zhì)的C端含反應(yīng)中心環(huán)(Reactive center loop，RCL)，而SP13 C端不含RCL。時(shí)空表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，SP2基因在2齡幼蟲中的表達(dá)量最高，而雄蠅的表達(dá)量與卵期相比有所下調(diào)；SP13基因在蛹中的表達(dá)量最高，1齡幼蟲和雌蠅中的表達(dá)量與卵期相近；SP16基因在2齡幼蟲和3齡幼蟲中的表達(dá)量最高，雄蠅與雌蠅的表達(dá)量與卵期相比有所下調(diào)。在家蠅3齡幼蟲的各主要組織中，以體壁為參照，SP2基因在唾液腺表達(dá)水平最高，其次是脂肪體，中腸和馬氏管均低于體壁；SP13基因在馬氏管和脂肪體中的表達(dá)水平最高，中腸和唾液腺的表達(dá)量低于體壁；SP16基因在唾液腺、中腸、脂肪體和馬氏管的表達(dá)量均低于體壁。推測(cè)Serpin基因在家蠅個(gè)體發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)中起不同作用。

家蠅；絲氨酸蛋白酶抑制劑；克??；時(shí)空表達(dá)；生物信息學(xué)

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，Serpin)是蛋白酶抑制因子中最大也是最重要的超家族(Singh and Jairajpuri，2014)。Serpin主要是通過(guò)使用自殺底物原理特異性地與靶酶形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物,導(dǎo)致靶酶失活，終止過(guò)度免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)宿主本身起著免受損傷的作用。它們是一類單鏈蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體中，是一族能折疊形成保守的空間三維結(jié)構(gòu)且具有特異性的類自殺性底物抑制機(jī)制的蛋白酶抑制劑，一般包含350-500個(gè)氨基酸殘基，序列同源性約為30%，疏水區(qū)的同源性為70%(Rubyetal.，2006)左右。有抑制活性的Serpin是由蛋白主體和暴露在蛋白主體外的反應(yīng)中心環(huán)(reactive center loop，RCL)組成的，Serpin的核心結(jié)構(gòu)域極為保守,通常包含有3個(gè)β-折疊和8-9個(gè)α-螺旋，β-折疊命名為sA-sC，α-螺旋命名為hA-hI。RCL位于β片層A和C之間，暴露在Serpin的蛋白主體之外,將其分為20個(gè)家族，大多數(shù)是糖蛋白，為絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有免疫調(diào)節(jié)活性(黃薇和吳坤陸，2010；楊偉克等，2014；趙麗芳等，2016)；另一些家族成員因失去了原有的絲氨酸蛋白酶抑制活性，從而在動(dòng)物體中行使結(jié)合蛋白的功能，它是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，一旦平衡失調(diào)將會(huì)導(dǎo)致多種疾病產(chǎn)生，任何影響其活性的因素也會(huì)造成嚴(yán)重的病理性疾病(張兵等，2014；李冰等，2016)。如血液凝固、基質(zhì)重建、纖溶、補(bǔ)體形成、蛋白質(zhì)折疊、激素形成轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移分化、血壓調(diào)節(jié)和腫瘤抑制等生理功能都與其相關(guān)(Gattoetal.，2013)。此外，還參與機(jī)體多種天然免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。鑒于其重要的免疫調(diào)節(jié)與生理功能，絲氨酸蛋白酶抑制劑一直倍受研究者的青睞，同時(shí)如何將其更好地應(yīng)用于醫(yī)藥也成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。

家蠅Muscadomestica屬于雙翅目Diptera蠅科Muscidae家蠅屬M(fèi)usca，孳生環(huán)境復(fù)雜，攜帶有許多病原菌，傳播疾病，且自身不會(huì)被感染，是重要的媒介昆蟲，其強(qiáng)大的免疫防御機(jī)制日益引起研究者們的關(guān)注。為深入研究家蠅這種獨(dú)特免疫防御機(jī)制，本研究對(duì)家蠅3種Serpin基因及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并進(jìn)行克隆、時(shí)空表達(dá)模式的研究，這為進(jìn)一步研究Serpin基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試?yán)ハx

家蠅，由貴州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲教研室保種、傳代繁殖，家蠅幼蟲經(jīng)麥麩進(jìn)行飼養(yǎng)，家蠅成蟲以白糖和奶粉按1 ∶1比例混合飼養(yǎng)，另配無(wú)菌蒸餾水飼養(yǎng)，蒸餾水與白糖和奶粉的混合物應(yīng)盡量隔開，避免其污染。飼養(yǎng)條件：溫度28℃，相對(duì)濕度65%，光照周期10 L ∶14 D，家蠅3齡幼蟲均重25.5 mg。

1.1.2質(zhì)粒和菌株

pMD18-T Vector為克隆載體，購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell為克隆感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，E.coli-DH5α由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。

1.1.3主要試劑及設(shè)備

分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA marker DL2000，RNAiso Reagent(Total RNA提取試劑)，PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit，DNA凝膠回收試劑盒質(zhì)粒、氨芐青霉素、rTaq酶、DNA快速提取試劑盒(均購(gòu)自寶生物大連TaKaRa公司)；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)、瓊脂粉、瓊脂糖(sigma公司)；溴化乙啶(EB)溶液、甘油(Glycerol)(貴州鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；50×TAE電泳緩沖液(上海生工)，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，焦碳酸二乙酯(DEPC)，RNA保護(hù)劑(大連寶生物TaKaRa公司)；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等(成都金山試劑公司)；固相RNase清除劑(Surface RNase Erasol)(北京天恩澤基因科技有限公司)。顯微解剖鏡(尼康)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)；ABI7300熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Allegra 64R冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司)；超低溫冰箱(日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成

總RNA抽提按照TAKARA公司的RNAiso PLUS說(shuō)明書進(jìn)行操作，包括家蠅不同發(fā)育時(shí)期和家蠅3齡幼蟲不同組織間的RNA的提取。總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)，GeneQuant公司核酸定量分析儀測(cè)定A260/A280比值及濃度，選取A260/A280的比值范圍為1.80-2.00的樣本，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書合成cDNA模板。

1.2.2家蠅Serpin基因克隆的引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增

根據(jù)家蠅的基因組序列篩選到3條家蠅Serpin基因編碼序列的ORF，GenBank登錄號(hào)分別為：XM_005177750.1、XM_005179781.1、XM_005187352.1，利用Primer 5.0和DNA Club軟件分別進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，SP2F:5′-ATGGGTACCAATGGTGAAACGG CT-3′，SP2R:5′-TTACGTCGACATTCCGGCAAAAG TTCCC-3′,SP13F:5′-ATGGAAGTGTTGAGTAAAG TAC-3′,SP13R:5′-TTACAATGATACAACATGGC C-3′,SP16F:5′ATGACTATAGCCCCCTCAGAAATG GC-3′,SP16R:5′-TCAAAACTTTGAAACATGACC GGC-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；60℃退火90 s；72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定產(chǎn)物特異性及分子量大小，并用DNA凝膠回收試劑盒回收和純化目的產(chǎn)物。將其純化后的PCR產(chǎn)物亞克隆入pMD18-T載體，陽(yáng)性克隆送上海生工生物公司測(cè)序鑒定。

1.2.3運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)Serpin基因進(jìn)行分析

利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System, ExPASy, http://ca.expasy.org/)提供的生物信息學(xué)工具分析家蠅Serpin基因的特點(diǎn)；運(yùn)用NCBI Blast對(duì)基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，用ProtParam分析蛋白等電點(diǎn)、分子質(zhì)量；ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性；Singl P4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)分析資源IEDB Analysis Recource網(wǎng)站(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)分析抗原表位；利用EMBL-EBI的在線分析工具InterProScan分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域以及活性位點(diǎn)；利用Clustal W和MEGA 5.1軟件進(jìn)行序列同源比對(duì)以及采用鄰接法構(gòu)建Serpin基因分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與基因擴(kuò)增

采用Primer 5.0軟件，根據(jù)家蠅3種Serpin基因cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，擴(kuò)增片段大小分別為162 bp、106 bp、257 bp，以RPS18為內(nèi)參基因，擴(kuò)增片段大小為337 bp，SP2-F:5′-CCAAATCAGGCAGTAAATG-3′，SP2-R:5′-CTCAGCAGGTATGGGTAAT-3′，SP13-F:5′-GCTCT ATTGTGGTGCCTAT-3′，SP13-R:5′-ATCCGATGTC ATTTTGG-3′，SP16-F:5′-TCAACAACTGGGTGGA GG-3′，SP16-R:5′-CAAGACTTTGGCATCGTAT-3′，RPS18-F:5′-AAGGGTGTGGGTCGCCGTT-3′，RPS18-R: 5′-GCAATGGGTTGGAGATGAT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95℃ 35 s，95℃ 5 s，60℃ 35 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用比較CT值法，確定特定熒光域值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的CT值，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。發(fā)育時(shí)期的結(jié)果以卵期作為參照進(jìn)行對(duì)比，組織的以體壁作為參照進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠅Serpin基因的擴(kuò)增和克隆

現(xiàn)將篩選到的具有潛在免疫調(diào)節(jié)功能的3條Serpin基因序列，通過(guò)設(shè)計(jì)合成的上、下游引物擴(kuò)增出目的基因片段，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SP2、SP13、SP16的PCR產(chǎn)物分別在1191 bp、1137 bp、1212 bp左右有一特異性條帶(圖1)，這與預(yù)期的片段大小相一致，并進(jìn)行了TA克隆，挑選的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序與目的基因序列相一致，最終篩選的這3條Serpin基因序列分別為SP2、SP13、SP16，并且將其登陸到GenBank，獲得的登錄號(hào)分別為KJ872511.1、KJ872490.1、KJ872492.1。

圖1 家蠅3種Serpin的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel analysis of three Serpin from housefly larvae1，DL2000 DNA Marker；2，SP2的PCR產(chǎn)物；3，SP13的PCR產(chǎn)物；4，SP16的PCR產(chǎn)物。1,DL2000 DNA Marker; 2, The PCR product of SP2; 3, The PCR product of SP13; 4, The PCR product of SP16.

2.2 家蠅Serpin基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI的Blastn在線分析工具對(duì)家蠅3種Serpin基因的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示3種Serpin基因都屬于Serpin超家族，都具有Serpin基因的保守結(jié)構(gòu)域，并且Serpin2和Serpin16還具有中央反應(yīng)環(huán)RCL，這是能夠被靶酶特異性識(shí)別的位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：家蠅SP2、SP13、SP16基因cDNA序列的ORF全長(zhǎng)分別為1191 bp、1137 bp、1212 bp，分別編碼396、378、403個(gè)氨基酸，基因編碼蛋白的理論分子量分別為45315.3 Da、43701.5 Da、45011.5 Da，等電點(diǎn)分別為9.01、5.98、6.04。若其成熟肽N端為蛋氨酸時(shí)，在哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為30 h，在酵母和大腸埃希菌中體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別>20 h和10 h。SP2蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為39.98，低于域值40，說(shuō)明該蛋白質(zhì)在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定；SP13蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為41.73，高于域值40，說(shuō)明該蛋白質(zhì)在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定；SP16蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為30.52，低于域值40，說(shuō)明該蛋白質(zhì)在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。SP2、SP13、SP16蛋白的疏水指數(shù)分別為84.77、92.65、84.76，總親水性分別為-0.210、-0.200、-0.209，蛋白質(zhì)總體疏水性均較高。

運(yùn)用ExPASy中的Signal P4.1在線分析可知，SP2基因編碼蛋白質(zhì)的第1-25位氨基酸為信號(hào)肽，SP13基因編碼蛋白質(zhì)的第1-20位氨基酸為信號(hào)肽，SP16基因編碼蛋白質(zhì)的第1-24位氨基酸為信號(hào)肽，均屬于分泌型蛋白。

抗原表位分析：運(yùn)用IEDB Analysis Resource中B Cell Epitope Prediction Tools分析預(yù)測(cè)3種Serpin氨基酸序列的B細(xì)胞抗原表位結(jié)果顯示，SP2氨基酸序列中4個(gè)分值較高的線性表位分別位于aa46-aa53(TESKSQNT)、aa70-aa80(GTN GETADEIE)、aa84-aa96(RQYNNGEADIPDK)和aa197-aa216(PIPAEGMQEKPFRVSPTSRV)；SP13氨基酸序列中4個(gè)分值較高的線性表位位于aa21-aa25(NPVVE)，aa67-aa70(GYTA)，aa127-aa130(PFHS)，aa336-aa339(ESDA)；SP16氨基酸序列中9個(gè)分值較高的線性表位分別位于aa22-aa33(TTAGTIAPSEMA)、aa71-aa79(TGADGEAAQ)、aa90-aa97(GDKRQVAK)，aa150-aa160(VNFHNSQETIQ)、aa165-aa173(WVEEQTENK)、aa179-aa187(QPGSVDGTT)，aa233-aa242(KFQYGEFPKY)、aa335-aa342(PASQKVSD)和aa353-aa360(EAGSEAAA)。SP2與SP16兩者之間在aa71-aa79和aa90-aa96序列均有明顯表位，SP13與SP16兩者之間在aa22-aa25和aa336-aa339序列均有明顯表位，但是其氨基酸不一致，僅個(gè)別氨基酸相同。

2.3 家蠅Serpin系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從NCBI上下載各物種的已知功能的Serpin氨基酸序列，其物種的來(lái)源主要有昆蟲綱雙翅目的果蠅Drosophilamelanogaster，舌蠅Glossinamorsitansmorsitans及岡比亞按蚊Anophelesgambiae，鱗翅目的家蠶Bombyxmori及煙草天蛾Manducasexta，鞘翅目的黃粉蟲Tenebriomolitor及赤擬谷盜Triboliumcastaneum，還有哺乳綱嚙齒目的小家鼠Musmusculus。采用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，并計(jì)算了它們之間序列的相似性，利用MEGA 5.1軟件對(duì)這些Serpin基因進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析，在構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的基礎(chǔ)上研究了家蠅3種Serpin的分類歸屬及其與其他物種Serpin之間的進(jìn)化關(guān)系。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)的結(jié)果中顯示，家蠅SP16與果蠅的Serpin43Aa的遺傳距離較近,其次家蠅SP13的遺傳距離也比較靠近果蠅的Serpin43Aa；而家蠅SP2與黃粉蟲的SPN40和SPN48遺傳距離較近。由于家蠅的SP2、SP13、SP16基因與其他物種報(bào)道的Serpin基因具有免疫和生理功能相關(guān)，最終篩選了這3條具有潛在免疫調(diào)節(jié)功能的Serpin基因進(jìn)行了相關(guān)研究。

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Analysis of phylogenetic tree

2.4 家蠅3種Serpin基因時(shí)空表達(dá)的差異

2.4.1家蠅3種Serpin基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況

家蠅3種Serpin基因在家蠅卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、雌蠅和雄蠅各生長(zhǎng)發(fā)育階段均顯現(xiàn)出差異表達(dá)。家蠅SP2基因在2齡幼蟲中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量程度從大到小依次排列為：2齡幼蟲>1齡幼蟲>3齡幼蟲>蛹>雌蠅>卵>雄蠅；家蠅SP13基因在蛹期中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量程度從大到小依次排列為：蛹>3齡幼蟲>雄蠅>2齡幼蟲>1齡幼蟲>雌蠅>卵；家蠅SP16基因在2齡幼蟲和3齡幼蟲中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量程度從大到小依次排列為：2齡幼蟲>3齡幼蟲>蛹>1齡幼蟲>卵>雄蠅>雌蠅(圖3)。

2.4.2家蠅3種Serpin在家蠅3齡幼蟲不同組織中的表達(dá)情況

家蠅3種Serpin基因分別在家蠅3齡幼蟲主要組織中表達(dá)量情況，以體壁作為參照，家蠅SP2基因在唾液腺表達(dá)水平最高，其在各組織表達(dá)量從大到小依次為：唾液腺>脂肪體>體壁>中腸>馬氏管；家蠅SP13基因在馬氏管和脂肪體中的表達(dá)水平最高，在各組織表達(dá)量從大到小為：馬氏管>脂肪體>體壁>唾液腺>中腸；家蠅SP16基因在體壁中的表達(dá)水平最高，在各組織表達(dá)量從大到小依次為：體壁>馬氏管>中腸>唾液腺>脂肪體(圖4)。

圖3 家蠅3種Serpin基因在生活史不同發(fā)育階段的表達(dá)差異Fig.3 Variation in expression of three Serpin gene in the life cycle of housefly

圖4 家蠅3種Serpin基因在3齡幼蟲不同組織部位的表達(dá)差異Fig.4 Variation in expression of three Serpin gene in different tissues of housefly

3 結(jié)論與討論

家蠅是一種世界性廣泛分布的一類媒介昆蟲，孳生環(huán)境及其復(fù)雜，鮮見病原微生物自身感染現(xiàn)象，這將歸功于其獨(dú)特、強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)。而絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine Protease Inhibitor，Serpin)作為其調(diào)節(jié)先天性免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控因子，在免疫系統(tǒng)調(diào)控作用中發(fā)揮重要的作用。

本研究根據(jù)NCBI上公布的家蠅全基因組預(yù)測(cè)序列以及課題組前期工作中構(gòu)建的家蠅3齡幼蟲熱脅迫cDNA文庫(kù)(劉紅美等，2010)篩選出了3條具有潛在免疫調(diào)節(jié)功能的Serpin基因，成功克隆了這些基因的cDNA序列，并已上傳登陸至GenBank，獲得了相應(yīng)的登錄號(hào)。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)這些Serpin基因分析表明，家蠅SP16和SP13與果蠅Serpin43Aa的親緣關(guān)系最為接近，果蠅Serpin43Ac(Greenetal.，2000)發(fā)揮作用的原理和果蠅Serpin43Aa是一致的，而果蠅Serpin43Aa基因?qū)τ跈C(jī)體抵抗外界微生物感染中起到非常重要的作用，當(dāng)機(jī)體發(fā)生過(guò)度免疫時(shí)，可通過(guò)抑制作用阻斷Toll信號(hào)通路的信號(hào)傳遞，進(jìn)而終止過(guò)度的免疫反應(yīng)，從而避免機(jī)體損傷。家蠅SP2與黃粉蟲SPN40和SPN48親緣關(guān)系最為相近，而鞘翅目昆蟲黃粉蟲中已經(jīng)證實(shí)SPN40、SPN48和SPN55為黃粉蟲天然免疫的重要負(fù)調(diào)控因子(Jiangetal.，2009)。這為以后研究家蠅SP2、SP13、SP163基因的生物學(xué)功能提供了很好的思路。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Yeonimetal.，2014；Hidetoetal.，2015；王玉倩和薛秀花，2016)結(jié)果表明，家蠅SP2、SP13和SP16在家蠅的卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、雌蠅和雄蠅各生長(zhǎng)發(fā)育階段均有不同程度的表達(dá)。家蠅SP2基因在2齡幼蟲表達(dá)量是最高，其次是1齡幼蟲和3齡幼蟲，在雄蠅階段表達(dá)量是最低；家蠅SP13基因在蛹期表達(dá)量是最高，其次是雄蠅、3齡幼蟲和2齡幼蟲，在卵期、1齡幼蟲和雌蠅中表達(dá)量是最低；家蠅SP16在2齡幼蟲和3齡幼蟲表達(dá)量是最高，其次是蛹期和1齡幼蟲，在卵期、雌蠅和雄蠅中表達(dá)量是最低。Bmserpin-6基因在家蠶各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),在4齡眠期、5齡6 d、吐絲48 h(化蛹前)和化蛹6 d的轉(zhuǎn)錄水平較高,在5齡 4 d、吐絲初期和蛹末期的轉(zhuǎn)錄水平較低(俞燕芳等，2010)。從以上結(jié)果分析表明，Serpin基因在家蠅2齡幼蟲和3齡幼蟲中呈普遍的高表達(dá)，而這兩個(gè)時(shí)期也是家蠅整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期最活躍、進(jìn)食最多、生長(zhǎng)最快的階段，推測(cè)Serpin基因可能參與了家蠅的個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育，由于進(jìn)食很多且食物中或多或少存在有一些病原微生物，家蠅幼蟲卻能正常生長(zhǎng)，推測(cè)家蠅Serpin基因在抵抗外來(lái)的微生物免疫防御過(guò)程中發(fā)揮著作用。這與本研究結(jié)果家蠅SP16與果蠅的Serpin43Aa(Ambadapadietal.，2016)的遺傳距離較近，且果蠅Serpin43Aa對(duì)于機(jī)體抵抗外界微生物感染中起到非常重要的作用相吻合。而家蠅SP13基因在蛹期呈現(xiàn)高表達(dá)量，推測(cè)家蠅的SP13基因可能在其進(jìn)行變態(tài)發(fā)育過(guò)程中起著相關(guān)作用。棉鈴蟲Haserpin的mRNA存在于各個(gè)組織，但Haserpin在6齡變態(tài)時(shí)期表達(dá)量明顯高于幼蟲取食期，這暗示Haserpin可能參與變態(tài)過(guò)程(張鳳霞，2010)。

家蠅SP2、SP13和SP16在家蠅3齡幼蟲不同組織馬氏管、脂肪體、體壁、唾液腺和中腸中均有不同程度的表達(dá)。唾液腺是昆蟲主要的消化器官，也是昆蟲接觸食物的第一道防線，其能分泌多種消化酶，研究表明唾液腺在昆蟲的免疫防御系統(tǒng)中扮演著重要的角色，而家蠅屬于雜食性的昆蟲，所進(jìn)食的食物多含有病原微生物，家蠅SP2基因在唾液腺中高表達(dá)，說(shuō)明可能其在家蠅的免疫防御系統(tǒng)中起著重要作用。家蠶Serpin16基因在幼蟲絲腺的特異表達(dá)模式提示其可能與家蠶的吐絲過(guò)程密切相關(guān)，推測(cè)該基因在維持絲腺穩(wěn)定的泌絲環(huán)境中發(fā)揮重要作用(董照明等，2010)。體壁是昆蟲直接接觸環(huán)境的主要組織，也是昆蟲自我防御的重要屏障，它是對(duì)抗環(huán)境傷害的第一道防線，而家蠅生活的環(huán)境非常復(fù)雜，經(jīng)常出沒于骯臟腐敗之地，將自身置身于不計(jì)其數(shù)的病原菌中，卻能安然無(wú)恙地生長(zhǎng)繁殖，這可能是由于家蠅體壁本身的防御機(jī)制以及家蠅強(qiáng)大的免疫防御系統(tǒng)的作用，家蠅SP16基因在體壁中高表達(dá)，推測(cè)家蠅SP16基因在對(duì)抗外來(lái)微生物免疫防御中起著重要作用。家蠶Bmserpin-6 mRNA在4齡幼蟲的頭部、表皮、中腸、絲腺和脂肪體中有轉(zhuǎn)錄,其中在表皮中高水平轉(zhuǎn)錄(王彥云等，2013)。然而，家蠅SP2、SP13和SP16基因在中腸中表達(dá)量都普遍較低，推測(cè)可能是由于在中腸內(nèi)側(cè)存在圍食膜(胡小龍和吳小鋒，2012；姜姍彤等，2012；Huetal.，2013；Kariuetal.，2013；Jacobetal.，2014)的原因，它是由中腸上皮細(xì)胞分泌的非細(xì)胞薄膜狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分泌細(xì)胞在中腸所處的位置,可將圍食膜分為Ⅰ型和Ⅱ型，主要成份由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。因?yàn)閲衬な堑种仆鈦?lái)微生物侵?jǐn)_的一道天然屏障，所以在昆蟲發(fā)育過(guò)程中需要不停更新以保證圍食膜的完整性和通透性，從而使得昆蟲在抵抗外來(lái)微生物侵襲的免疫防御過(guò)程中起著重要作用。

通過(guò)生物信息學(xué)分析，有利于全面詳細(xì)地了解家蠅3種Serpin蛋白的特性、結(jié)構(gòu)、功能等信息；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析，推測(cè)家蠅SP2基因在家蠅生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用；家蠅SP13基因在家蠅生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，尤其在蛹期進(jìn)行變態(tài)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用；家蠅SP16基因主要在免疫防御過(guò)程中起著重要的作用。這為以后對(duì)于該蛋白的后續(xù)研究具有一定的理論指導(dǎo)意義，也為今后研究其生物學(xué)與免疫學(xué)功能打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Cloning,sequenceanalysisandexpressionpatternofthreeserineproteaseinhibitor(Serpin)inMuscadomestica

WEI Chuan-Chuan2, XIU Jiang-Fan1*, HU Ya1, SHANG Xiao-Li1, ZHANG Ying-Chun1, WU Jian-Wei1

(1. Basic Medical College, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China; 2. Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004, China)

To probe into the cloning, sequence analysis and temporal expression patterns of threeSerpingenes inMuscadomestica.SP2,SP13 andSP16 genes were cloned fromM.domestica, and their sequences was analyzed. Expert protein analysis system (ExPaSy) of institute of biological information science in Switzerland and national center for biotechnology information (NCBI) from America, and relevant bioinformatics analysis tool were used to predict and analyze the structures and biological functions of threeSerpingenes. The expression ofSP2,SP13 andSP16 gene were detected by Real-time quantitative PCR (Real Time PCR) technique performed in differential developmental stages, and the expression features in fat body, salivary glands, midgut, markov tube and body wall from three instar larvae ofM.domestica, the RPS18 (ribosomal protein S18) as control. The full-length ofSP2,SP13 andSP16 genes were 1191 bp, 1137 bp and 1212 bp, and they encoded 396 aa、378 aa and 403 aa respectively. The predicted molecular weight ofSP2,SP13 andSP16 were 45315.3 Da， 43701.5 Da and 45011.5 Da, and isoelectric point were 9.01, 5.98 and 6.04,respectively. All of them contained a signal peptide, and the C terminal ofSP2 andSP16 contained a reactive center loop, whileSP13 had not. The spatial and temporal expression patterns showed that the expression of SP2 gene was highest in the second instar larvae, but that was reduced compared with the egg stage, while the expression ofSP13 was highest in the pupa, and the expression of first instar larvae and female similar with the eggs. Besides, the expression ofSP16 gene was highest in the second instar larvae and third instar larvae, but the expression of male and female were reduced compared to the egg stage. The expression of these genes in the major organizations of third instar larvae inM.domesticashowed that the expression ofSP2 was highest in the salivary glands, then in fat body, midgut and Markov tube were lower than that of body wall, the expression in body wall as control; while the expression ofSP13 gene was highest in the Markov tube and fat body, then was body wall, midgut and salivary glands. At last, the expression ofSP16 gene was highest in the body wall, then was fat body, salivary glands, midgut and Markov tube in that order. The results indicated that these genes play different roles in the individual development and immune regulation ofM.domestica.

Muscadomestic; serine protease inhibitor; cloning; temporal expression patterns; bioinformatics

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Q963

A

1674-0858(2017)06-1334-08

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360254)；黔科合NY[2014]3054號(hào)；黔科合LH字[2014]7076；貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(gzwjkj2014-2-100)

魏川川，男，1987年生，貴州貴陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)槔ハx分子生物學(xué)，E-mail：752308241@qq.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: xiujiangfan@163.com

Received: 2016-08-08; 接受日期Accepted: 2016-11-07