張穎穎，李慧晨，吳彥超，李瑩瑩*

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物性食品中8 種抗病毒類藥物殘留量

張穎穎，李慧晨，吳彥超，李瑩瑩*

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

建立同時(shí)測(cè)定雞肉、豬肉、雞肝和豬肝中阿比朵爾、金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋、帕拉米韋、咪喹莫特、奧司他韋、拉米夫定8 種抗病毒藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法。樣品采用乙腈-0.1%甲酸溶液（9∶1，V/V）經(jīng)一次性振蕩提取，用MCX固相萃取柱凈化，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：8 種抗病毒藥物的檢出限均低于1.0 μg/kg，定量限均低于3.0 μg/kg，空白雞肉、雞肝、豬肉、豬肝中分別添加5.0、10.0 μg/kg和20.0 μg/kg，8 種抗病毒藥物的回收率均在70%～120%之間。該方法基質(zhì)干擾小、靈敏度高、回收率好，可用于日常動(dòng)物性樣品中抗病毒類藥物的殘留檢測(cè)。

抗病毒類藥物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；雞肉；雞肝；豬肉；豬肝

抗病毒類藥物原是用于治療人類流行性感冒的一類藥物，但多次大型流感的爆發(fā)[1]，如1997年中國(guó)香港爆發(fā)的H1N5流感；2013年中國(guó)內(nèi)地發(fā)生的H7N9流感，其極高的畜禽發(fā)病率及死亡率均造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此養(yǎng)殖者便將抗病毒類藥物添加至畜禽飼料中以降低發(fā)病率，甚至一些不法商販為謀取不正當(dāng)利益，避免“速成雞”[2]生病死亡，也大量喂食抗病毒類藥物。然而非法使用抗病毒類藥物會(huì)造成動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留，加大病毒的耐藥性及變異的可能性，甚至部分殘留的抗病毒類藥物，如金剛烷胺、金剛乙胺，會(huì)損傷人體的生殖系統(tǒng)，并造成不可恢復(fù)性的損傷。因此多個(gè)國(guó)家均將抗病毒類藥物列為禁用藥物，2005年我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了560號(hào)公告，明文規(guī)定養(yǎng)殖業(yè)禁止使用金剛烷胺、利巴韋林類抗病毒藥物[3]，2006年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局也明文規(guī)定禁止將人類抗病毒類藥物用于禽類飼養(yǎng)過(guò)程中[4]。

目前，有關(guān)抗病毒類藥物殘留的檢測(cè)方法的報(bào)道較多[5]，有酶聯(lián)免疫法[6-7]、氣相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、液相色譜法[11-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]、毛細(xì)管電泳法[16-17]、分光光度法[18-19]、近紅外法[20-21]、電化學(xué)法[22]以及芯片法等。但由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜所采用的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式定性及定量的高準(zhǔn)確性、高分辨率、高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，可用于各種基質(zhì)樣品的檢測(cè)，如雞蛋[23-25]、雞肉[26-29]、雞肝[30]、豬肉[31]，已成為當(dāng)前用于檢測(cè)抗病毒類藥物殘留的主要方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行分析總結(jié)，建立一種基質(zhì)干擾小、分析速度快，可用于測(cè)定雞肉、豬肉、雞肝和豬肝中阿比朵爾、金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋、帕拉米韋、咪喹莫特、奧司他韋、拉米夫定8 種抗病毒藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。8 種抗病毒藥物分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 8 種抗病毒化合物的結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Chemical structures of eight antiviral compounds

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿比朵爾、金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋、帕拉米韋、咪喹莫特、奧司他韋、拉米夫定、阿比朵爾-D6、金剛烷胺-D6、奧司他韋-D3、拉米夫定-13C 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙腈、甲醇、乙酸、氨水、三氯乙酸、鹽酸、甲酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司；MCX固相萃取柱 美國(guó)Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及Xcalibur 2.2與LCquan 2.8數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國(guó)Thermo公司；HENGAO T&D固相萃取裝置 美國(guó)Agilent公司；CR21N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；HGC-24A氮吹儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取阿比朵爾、金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋、帕拉米韋、咪喹莫特、奧司他韋、拉米夫定8 種標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（根據(jù)溶解度可適當(dāng)加水溶解），于4 ℃的冰箱中冷藏保存。使用時(shí)依次用水稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

分別準(zhǔn)確稱取阿比朵爾-D6、金剛烷胺-D6、奧司他韋-D3、拉米夫定-13C標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（根據(jù)溶解度可適當(dāng)加水溶解），于4 ℃的冰箱中冷藏保存。使用時(shí)用水稀釋至100 μg/L。

1.3.2 樣品制備

準(zhǔn)確稱取2 g樣品，加入100 μL 100 μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，加入5 mL乙腈-0.1%甲酸（9∶1，V/V）提取溶液，用玻璃棒攪勻后，繼續(xù)加入5 mL乙腈-0.1%甲酸溶液，振蕩1 h，取出，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；取5 mL上清液，加入5 mL水，混勻，通過(guò)已分別用甲醇、0.1%甲酸-水活化平衡后的MCX固相萃取柱，再分別用3 mL 2%甲酸溶液、甲醇淋洗MCX萃取柱，而后用氨水-甲醇溶液（5∶95，V/V）洗脫，洗脫溶液在50 ℃條件下氮?dú)獯蹈?，? mL 0.1%甲酸-甲醇（9∶1，V/V）溶液溶解殘?jiān)?/p>

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：T h e r m o H y p e r s i l G o l d C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：乙腈；二元梯度洗脫程序見表1。

表1 二元梯度洗脫程序Table 1 Binary gradient elution program

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：正離子模式；毛細(xì)管電壓3 000 V；毛細(xì)管溫度350 ℃；霧化溫度350 ℃；輔助氣壓力30 arb；鞘氣壓力10 arb；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集參數(shù)見表2。

表2 抗病毒類藥物的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 2 HPLC retention times and mass spectral parameters for antiviral drugs

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

由圖1可知，該類化合物均含有胺基基團(tuán)，在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，該類化合物易結(jié)合H質(zhì)子，帶正電荷，因此，在進(jìn)行質(zhì)譜掃描過(guò)程中采用正離子掃描模式。通過(guò)優(yōu)化離子源參數(shù)，確認(rèn)母離子峰，并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，確保每個(gè)母離子均有3 個(gè)子離子，同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)子離子能夠減少基質(zhì)造成的干擾，避免假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生，更能保證樣品的準(zhǔn)確性，最終為8 種抗病毒藥物選取合適的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)信息。

正離子掃描模式下，在液相色譜流動(dòng)相中加入少量的甲酸會(huì)增強(qiáng)待測(cè)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，這主要是由于酸提供了更多的H＋。因此本實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸溶液與乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)合適的梯度洗脫程序，從而保證各個(gè)化合物有良好的峰形、分離度及響應(yīng)強(qiáng)度。

2.2 樣品預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的選擇

8 種化合物中均含有極性基團(tuán)，根據(jù)相似相溶原理，此類化合物更易溶解于極性有機(jī)溶劑中，因此本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈與甲醇的提取效果，相比甲醇而言，乙腈沉淀蛋白脂肪的效果更強(qiáng)，離心后的溶液更為干凈，這為后續(xù)凈化步驟提供了便利；此外，化合物中所含的胺基基團(tuán)，在酸性條件下帶正電荷易溶于水，因此本實(shí)驗(yàn)分別考察了三氯乙酸、甲酸、鹽酸及其與不同比例的乙腈的提取效果。

圖2 8 種抗病毒藥物在不同提取溶劑條件下回收率Fig. 2 Recoveries of eight antiviral drugs extracted using different solvent systems

如圖2所示，提取溶液為乙腈-0.1%甲酸（1∶9，V/V）溶液時(shí)，8 種抗病毒藥物的回收率均在70%～110%之間，并不存在過(guò)高或過(guò)低的回收現(xiàn)象，因此本方法最終以乙腈-0.1%甲酸（1∶9，V/V）為提取溶液。

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化

由于8 種抗病毒藥物均含有胺基基團(tuán)，在酸性條件下帶正電荷，可在陽(yáng)離子交換固相萃取柱中進(jìn)行陽(yáng)離子交換作用，并吸附至固相萃取柱中，進(jìn)而與中性雜質(zhì)分離，從而使樣品得到凈化，因此本方法選用MCX混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。根據(jù)MCX柱的原理及化合物的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息，對(duì)淋洗溶劑、洗脫溶劑及定容溶劑分別進(jìn)行了考察，以8 種抗病毒類化合物的回收率為參數(shù)，最終選取最佳條件，結(jié)果如表3所示。

表3 抗病毒類藥物在不同操作條件下回收率Table 3 Comparison of the recoveries of eight antiviral drugs using different operating conditions

如表3所示，淋洗溶液為2%甲酸、甲醇時(shí)，各化合物的回收率最為適宜。而僅通過(guò)水進(jìn)行淋洗時(shí)，并不能完全將MCX柱上所吸附的其他雜質(zhì)洗脫下來(lái)，最終所得到的樣品溶液較為混濁，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；先用2%甲酸溶液淋洗，可使所測(cè)定的含堿性基團(tuán)的化合物與MCX柱的結(jié)合更為牢固，然后再用甲醇淋洗，可將中性雜質(zhì)，如脂肪、蛋白等，洗脫至廢液，進(jìn)而凈化樣品。對(duì)比洗脫溶液，發(fā)現(xiàn)5%氨水-甲醇溶液對(duì)8 種化合物的洗脫效果更好，并且加入異丙醇后，由于黏度增大，在后續(xù)氮吹過(guò)程中所消耗的時(shí)間更長(zhǎng)，降低了實(shí)驗(yàn)速度。由于8 種抗病毒類藥物在質(zhì)譜檢測(cè)中采用的是正模式，因此定容溶液中添加適量的有機(jī)酸溶液會(huì)增加化合物的響應(yīng)值，對(duì)比上述2 種定容溶劑，最終選擇0.1%甲酸-甲醇（9∶1，V/V）為定容溶液。

2.3 定量方法的確認(rèn)

本實(shí)驗(yàn)擬測(cè)定動(dòng)物性食品中8 種抗病毒類藥物，為保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。其中，金剛烷胺、拉米夫定、奧司他韋、阿比朵爾4 種化合物可分別用自身的同位素內(nèi)標(biāo)金剛烷胺-D6、拉米夫定-13C、奧司他韋-D3、阿比朵爾-D6進(jìn)行定量。而對(duì)于泛昔洛韋、咪喹莫特、金剛乙胺及帕拉米韋則需要進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)處理，根據(jù)回收率等條件，對(duì)上述4 種內(nèi)標(biāo)進(jìn)行選擇以保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。如圖3所示，咪喹莫特、泛昔洛韋在使用奧司他韋-D3為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量時(shí)回收率最佳，金剛烷胺、帕拉米韋在使用金剛烷胺-D6作為內(nèi)標(biāo)定量時(shí)回收率最佳，因此咪喹莫特、泛昔洛韋以?shī)W司他韋-D3作為內(nèi)標(biāo)，帕拉米韋、金剛乙胺以金剛烷胺-D6作為內(nèi)標(biāo)。

圖3 4 種抗病毒類藥物在不同內(nèi)標(biāo)條件下回收率Fig. 3 Comparison of the recoveries of four antiviral drugs using different internal standard compounds

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍及檢出限結(jié)果

8 種抗病毒類藥物的質(zhì)量濃度為1～50 μg/L，采用內(nèi)標(biāo)法，以待測(cè)物的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積之比作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；此外，在空白雞肉、雞肝、豬肝、豬肉樣品中加入8 種抗病毒類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過(guò)提取和凈化后，進(jìn)行儀器檢測(cè)，以3 倍信噪比為檢出限，以10 倍信噪比為定量限。8 種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限見表4。目前，我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4253—2015《出口動(dòng)物組織中抗病毒類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[32]中對(duì)抗病毒類藥物的檢測(cè)低限為1.0 μg/kg，《食藥監(jiān)食監(jiān)三便函[2014] 73號(hào) 動(dòng)物源性食品中金剛烷胺的檢測(cè)》中對(duì)金剛烷胺的檢測(cè)低限為5.0 μg/kg，因此，本實(shí)驗(yàn)建立的8 種抗病毒類藥物方法能夠符合國(guó)內(nèi)檢測(cè)的要求。

表4 方法的線性方程及靈敏度Table 4 Linearity and sensitivity of the developed method

2.4.2 回收率及精密度結(jié)果

表5 空白雞肉、雞肝、豬肉和豬肝中8 種藥物的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 5 Recoveries and relative standard deviation (RSD) of the eight drugs in blank chicken meat, pork meat, chicken liver and pork liver (n= 6)

分別在空白雞肉、雞肝、豬肉、豬肝中添加5.0、10.0 μg/kg和20.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加量分別做6 個(gè)平行，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。如表5所示，8 種抗病毒藥物的回收率在70%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于10%，其精密度和回收率均符合殘留分析方法的要求。空白雞肉樣品中添加10.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖，如圖4所示。

圖4 空白雞肉中添加10.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖譜Fig. 4 Multiple reaction monitoring mass spectra of blank chicken samples spiked with mixed standard solution and internal standards at 10.0 μg/kg

2.5 方法應(yīng)用

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)建立的前處理方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室留存的10 份雞肉、7 份雞肝、5 份豬肉和5 份豬肝樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中4 份雞肝檢出金剛烷胺殘留，其含量分別為6.2、40.3、5.7 μg/kg和32.5 μg/kg。其他化合物均未檢出。

3 結(jié) 論

本方法建立了雞肉、雞肝、豬肉、豬肝中阿比朵爾、金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋、帕拉米韋、咪喹莫特、奧司他韋、拉米夫定8 種抗病毒類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法。該方法采用乙腈-0.1%甲酸溶液（9∶1，V/V）一次性振蕩提取，用MCX固相萃取柱凈化，整個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間為7 min，簡(jiǎn)便快速。該方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，空白雞肉、雞肝、豬肉、豬肝中添加量為5.0、10.0、20.0 μg/kg，8 種抗病毒藥物的平均回收率為70%～120%，總體RSD小于10%。該方法操作簡(jiǎn)便，前處理干凈，基質(zhì)干擾少，回收率高，重復(fù)性好，滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，適合大批量樣品的監(jiān)測(cè)分析。

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Determination of Eight Antiviral Drug Residues in Animal-Derived Food by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Yingying, LI Huichen, WU Yanchao, LI Yingying*
(China Meet Food Research Center, Beijing 100068, China)

An efficient ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the simultaneous analysis of residues of 8 antiviral drugs (arbidol, amantadine, rimantadine, famciclovir,peramivir, imiquimod, oseltamivir, and lamivudine) in chicken meat and liver and pork meat and liver. Samples were extracted with 1% formic acid-acetonitrile, and the extract was subjected to chromatographic separation on MCX solidphase extraction column. Quantification of the analytes was achieved by UPLC-MS/MS using the internal standard method.The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the method were lower than 1.0 and 3.0 μg/kg for all the antiviral drugs, respectively. The average recoveries of 8 antiviral drugs in blank chicken meat, pork meat, chicken liver and pork liver at spiked levels of 5.0, 10.0, and 20.0 μg/kg ranged from 70% to 120%, with relative standard deviation (RSD) of less than 10%. The method had the advantages of small matrix interference, high sensitivity and good recovery. Therefore, it can be used for the detection of antiviral drugs residues in animal-derived food.

antiviral drugs; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS);chicken meat; chicken liver; pork meat; pork liver

10.7506/spkx1002-6630-201802048

TS207.3

A

1002-6630（2018）02-0303-07

張穎穎, 李慧晨, 吳彥超, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物性食品中8 種抗病毒類藥物殘留量[J]. 食品科學(xué),2018, 39(2): 303-309.

10.7506/spkx1002-6630-201802048. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yingying, LI Huichen, WU Yanchao, et al. Determination of eight antiviral drug residues in animal-derived food by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2018, 39(2): 303-309. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802048. http://www.spkx.net.cn

2017-05-07

張穎穎（1990—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：yingying_sys@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：李瑩瑩（1984—），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：ying_sky@126.com