鴨源大腸桿菌 Ⅰ 型菌毛的鑒定及FimA、FimH基因特征分析

黃書倫，鄭凱文，胡 洋，李章程，程方俊，2，*，宋振輝，2，周作勇，2，劉國林，林春發(fā)，林永潤，張婷婷

(1.西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2. 重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460)

鴨源大腸桿菌 Ⅰ 型菌毛的鑒定及FimA、FimH基因特征分析

黃書倫1，鄭凱文1，胡 洋1，李章程1，程方俊1，2，*，宋振輝1，2，周作勇1，2，劉國林1，林春發(fā)1，林永潤1，張婷婷1

(1.西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2. 重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460)

為了解川渝部分地區(qū)鴨源大腸埃希菌Ⅰ型菌毛產(chǎn)生情況及分子特征，采用MSHA/MRHA試驗、PCR擴增Ⅰ型菌毛基因(FimA、FimH)進行菌毛類型鑒定；通過分析FimA氨基酸序列的親水性、抗原性、表面可及性來預(yù)測抗原位點。MSHA/MRHA試驗結(jié)果顯示，MSHA檢測陽性率為44.3%；PCR檢測FimA陽性率為63.41%，F(xiàn)imH陽性率為100%。氨基酸序列比對結(jié)果顯示：FimA氨基酸序列與比對株大腸埃希菌(ECOR61)相比，存在19個差異位點；FimH氨基酸序列與比對株(ECOR45)相比，僅少數(shù)菌株出現(xiàn)1～2個氨基酸位點差異，表明該片段高度保守。對FimA氨基酸序列進行抗原位點預(yù)測，結(jié)果顯示，多數(shù)菌株抗原表位共同區(qū)域分布在84～88、142～146、149～150位氨基酸之間，除上述位點外，部分菌株在101～105、130～134位氨基酸出現(xiàn)抗原表位。

大腸埃希菌；Ⅰ型菌毛；氨基酸；序列比對；抗原表位

禽大腸埃希菌病(avian colibacillosis)是由禽致病性大腸埃希菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)引起的禽類急性、全身性腸外感染的一系列疾病的總稱，臨床上以心包炎、肝周炎、氣囊炎、蜂窩織炎、敗血癥及輸卵管炎、腹膜炎等為主要特征[1]。APEC是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原微生物之一，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，同時也是重要的食源性人畜共患病原菌[2-3]。禽大腸埃希菌菌毛主要有Ⅰ型菌毛和P型菌毛2種，Ⅰ型菌毛作為一種重要的毒力因子，在大腸埃希菌感染過程中可介導(dǎo)細菌與多種細胞的D-甘露糖受體特異性結(jié)合，使細菌黏附于消化道黏膜表面從而引起感染，而P型菌毛僅在細菌進一步致病過程中起作用[4]。致病性大腸埃希菌的菌毛具有良好的免疫原性[1]，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體，可用于菌毛亞單位疫苗的制備。Ⅰ型菌毛由多個基因群編碼，其中FimA基因是Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位基因，F(xiàn)imH基因可負責(zé)Ⅰ型菌毛甘露糖特性的表達和特殊黏附素受體的識別[5]。大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的檢測常用電子顯微鏡檢查、甘露糖敏感血凝試驗及甘露糖抵制血凝試驗(MSHA/MRHA)、玻板凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、核酸探針及PCR擴增等方法。目前，國內(nèi)對鴨源大腸埃希菌Ⅰ型菌毛FimH基因的報道較少，尚未見重慶地區(qū)鴨源大腸埃希菌菌毛相關(guān)研究報道。

為了解重慶、四川地區(qū)禽大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的產(chǎn)生情況及分子特征，本試驗采用MSHA/MRHA及PCR擴增，對2005—2015年收集的重慶、四川部分地區(qū)鴨源大腸埃希菌分離株進行Ⅰ型菌毛鑒定，并通過FimA和FimH序列分析和FimA抗原位點預(yù)測，為鴨源大腸埃希菌的防控及亞單位疫苗的制備提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及供試動物

70株鴨源大腸埃希菌菌株由西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院鑒定保存。其中，2005—2015年從重慶多地區(qū)分離到42株，以YC N-n、RC N-n編號，四川地區(qū)分離到28株，以LC N-n編號；豚鼠購自重慶市中藥研究院。

1.2 主要試劑

小劑量DNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker購自生工生物工程(上海)有限公司；PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA回收試劑盒購自廣州飛揚生化有限公司；D-甘露糖、改良Minka培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、1%豚鼠紅細胞懸液等。

1.3 引物及參考序列

FimA和FimH基因分別參考文獻[6-7]設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列如下：FimA基因(預(yù)擴增長度315 bp)上游引物5’-AGTTAGGACAGGTTCGTACCGCAT-3’，下游引物5’-AAATAACGCGCCTGGAACGGAATG-3’；FimH基因(預(yù)擴增長度508 bp)上游引物5’-TGCAGAACGGATAAGCCGTGG-3’，下游引物5’-GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA-3’。

1.4 MSHA/MRHA試驗

將各菌株分別用改良Minka液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，同樣培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代3次，即為菌毛化菌體。細菌懸液濃度控制為約109cfu·mL-1，甘露糖敏感血凝試驗及甘露糖抵制血凝試驗(MSHA/MRHA)按文獻[8]所述方法作適當(dāng)調(diào)整。每株細菌進行3組平行實驗。

1.5 FimA和FimH基因的PCR擴增

根據(jù)MSHA/MRHA試驗結(jié)果，選取41株菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用基因組提取試劑盒提取其基因組，作為擴增菌毛基因的模板。采用上述引物，分別對FimA和FimH基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：上、下游引物(20 pmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2.0 μL，2×PremixExTaq12.5 μL，總體積25 μL。FimA基因PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個PCR循環(huán)；72 ℃ 10 min。FimH基因PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。對目的片段進行回收與純化，送生工生物工程(上海)有限公司測序。測序結(jié)果利用NCBI的Blast在線翻譯成氨基酸序列后，采用軟件MEGA 5.0進行比對，運用DNA Star Protean程序預(yù)測FimA的抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSHA/MRHA試驗結(jié)果

70株鴨源大腸埃希菌MSHA/MRHA試驗結(jié)果顯示，有31株可以產(chǎn)生紅細胞凝集現(xiàn)象且不能抵抗D-甘露糖的抑制作用，39株未出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象，空白對照組無自凝現(xiàn)象，部分結(jié)果見圖1。表明31株菌毛化大腸埃希菌呈MSHA陽性，陽性率為44.3%，其中，重慶分離株陽性率為45.2%，四川分離株陽性率為42.9%。

2.2 FimA和FimH基因檢測結(jié)果

共檢測41株菌株，其中，26株菌株可擴增出與FimA基因片段大小相符的條帶(約300 bp)，PCR檢測陽性率為63.41%，其中，重慶分離株陽性率為64%，四川地區(qū)分離株陽性率為62.5%；15株未擴增出目的片段，部分結(jié)果見圖2。41株菌株均能擴增出與FimH基因片段大小相符的條帶(約500 bp)，陽性率為100%，部分結(jié)果見圖3。

1， RC2-2; 2， LC4-2; 3， LC4-1; 4， LC2-4; 5， LC3-6; 6， RC2-1; 7， RC1-2; 8， LC2-3; 9， LC1-5; 10， YC1-2; 11， YC1-1; M， DL 2 000 DNA Marker圖2 部分大腸埃希菌FimA基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of FimA gene from some Escherichia coli strains

12， LC1-4; 13， LC3-5; 14， LC1-3; 15， LC4-2; 16， LC3-4; 17， LC3-3; 18， LC1-2; 19， LC1-1; 20， LC3-2; 21， LC3-1;M， DL 2 000 DNA Marker圖3 部分大腸埃希菌FimH基因PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of FimH gene from some Escherichia coli strains

2.3 FimA氨基酸序列比對

將26株鴨源大腸埃希菌和GenBank中的大腸埃希菌ECOR61(登錄號為KC405511.1)的FimA基因核苷酸序列在線翻譯成氨基酸序列后進行對比，結(jié)果顯示，F(xiàn)imA基因編碼97個氨基酸(FimA 65-161)，與參考株相比，有19個氨基酸位點存在差異(表1)。

2.4 FimH氨基酸序列比對

將41株大腸埃希菌和GeneBank中的大腸埃希菌ECOR45(登錄號為FJ865819.1)的FimH核苷酸序列在線翻譯成氨基酸序列后進行比對，結(jié)果顯示，所擴增條帶可編碼162個氨基酸(FimH 125-287)，其中，僅RC3-4菌株180位點(R→H)、11株菌株在228位點(A→V)出現(xiàn)差異。由此推斷，該FimH氨基酸片段高度保守。

2.5 FimA抗原位點

運用DNA Star Protean程序預(yù)測FimA氨基酸序列抗原表位，結(jié)果顯示，多數(shù)菌株抗原表位區(qū)域主要分布在84～88、142～146、149～150位氨基酸(如LC1-1，圖4)。除上述位點外，部分菌株在101～105位(如RC1-2，圖5)、130～134(如RC1-3，圖6)位氨基酸出現(xiàn)抗原表位。

表12005—2015年重慶、四川部分鴨源大腸埃希菌FimA氨基酸位點比對

Table1Comparison of FimA amino acid mutation sites inEscherichiacolifrom some ducks in Chongqing and Sichuan from 2005 to 2015

菌株編號StrainsNo．氨基酸殘基位點Sitesofaminoacidresidue78879094100103104105106107121129132133135140142143144KC4055111NNSVAAGHTNNRAATTSSELC1?1--------------A----LC1?2--------------A----LC1?3--------------A----LC1?4--------------A----LC1?5--------------A----LC1?6--------------A----LC2?1-----------------EQLC2?2Y----V-------------LC2?3Y-------------A----LC2?4Y-------------A----RC1?1YTDI-GT-P-K---A--AQRC1?2-TDI-GT-P-K---A--AQRC1?3-ST--SA-PK--NE---AQRC1?4-ST--SA-PK--NE---AQRC1?5-ST--SA-PK--NE---AQRC2?1YD--TTN----K--AS-AQRC2?2-D--TTN----K--AS-AQRC2?3-D--TTN----K--AS-AQRC2?4-D--TTN----K--AS-AQRC2?5-D--TTN----K--AS-AQYC1?1-TT----R-D--N----AQYC1?2-TT----R-D--N----AQYC1?3-TT----R-D--N---MAQYC1?4-TT------D----A---KYC1?5-TT------D----A-I-KYC1?6-TT------D-K--A---Q

圖4 LC1-1株FimA蛋白親水性、抗原性、表面可及性Fig.4 Hydrophilicity plot， antigenic index， surface probability plot of FimA protein from LC1-1 strain

3 結(jié)論與討論

大腸埃希菌在侵襲機體過程中，Ⅰ型菌毛對機體呼吸道的黏附起著重要作用，可介導(dǎo)細菌與多種細胞的D-甘露糖受體特異性結(jié)合，使細菌定居于黏膜表面從而引起感染，且這種特異性黏附能被D-甘露糖所抑制[9-11]，因而可通過D-甘露糖敏感血凝特性(MSHA)試驗對大腸埃希菌Ⅰ型菌毛進行初步的鑒定。本研究Ⅰ型菌毛鑒定中，MSHA陽性率為44.3%，四川地區(qū)報道185株鴨源致病性大腸埃希菌MSHA陽性率為65.9%，45株雞源致病性大腸埃希菌MSHA陽性率為80%[12-13]，表明不同地區(qū)、不同動物源的大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的表達情況存在差異。FimA基因檢測陽性率為63.41%，F(xiàn)imH基因陽性率為100%，兩者陽性率均高于MSHA陽性率，同國內(nèi)相關(guān)報道一致[12-14]，說明傳統(tǒng)的MSHA/MRHA試驗適用于檢測Ⅰ型菌毛的表達情況，即Ⅰ型菌毛表現(xiàn)型檢測，而FimA及FimH基因的PCR擴增對Ⅰ型菌毛基因攜帶情況檢測更具優(yōu)越性，即基因型檢測。本試驗中部分菌株檢測出Fim基因卻未表現(xiàn)MSHA陽性，即Ⅰ型菌毛未表達，研究表明Fim基因在表達過程中受到基因以外諸多因素的調(diào)控，推測外界環(huán)境影響了Ⅰ型菌毛的表達[15]。MSHA/MRHA試驗和PCR方法各有優(yōu)劣，在Ⅰ型菌毛鑒定過程中，應(yīng)根據(jù)實際情況采取不同方法或多種方法結(jié)合的方式進行。FimA和FimH基因檢測陽性率的差異以及Ⅰ型菌毛表達的影響因素還有待進一步研究。

圖5 RC1-2株FimA蛋白親水性、抗原性、表面可及性Fig.5 Hydrophilicity plot， antigenic index， surface probability plot of FimA protein from RC1-2 strain

圖6 RC1-3菌株FimA蛋白親水性、抗原性、表面可及性Fig.6 Hydrophilicity plot， antigenic index， surface probability plot of FimA protein from RC1-3 strain

試驗株與參考株FimA共有19個氨基酸位點差異，說明川渝地區(qū)鴨源大腸埃希菌Ⅰ型菌毛FimA在進化過程中存在不同程度的變異，部分菌株差異較大，氨基酸位點的差異對Ⅰ型菌毛具體功能的影響還有待進一步研究。本試驗結(jié)果顯示，多數(shù)菌株抗原表位共同區(qū)域分布在84～88、142～146、149～150位氨基酸，少數(shù)菌株在101～105、130～134位，說明川渝地區(qū)鴨源大腸埃希菌抗原表位存在變異。葉如俊等[16]報道，8株雞源致病性大腸埃希菌Ⅰ型菌毛蛋白在1～4、49～53、82～91、126～132、145～150位氨基酸有較高抗原性，本試驗結(jié)果與此大致相同，說明不同禽源大腸埃希菌一定程度上具有相同的抗原位點。致病性大腸埃希菌的Ⅰ型菌毛具有良好的免疫原性，雖然多數(shù)分離株具有相似的抗原位點，但在實際生產(chǎn)中，由于不同菌株Ⅰ型菌毛抗原位點的差異會影響亞單位疫苗的實際免疫效果。本試驗發(fā)現(xiàn)川渝部分菌株Ⅰ型菌毛的抗原表位存在差異，因此，在利用Ⅰ型菌毛制備亞單位疫苗時，應(yīng)充分考慮此因素，建議制備多價亞單位疫苗以增強臨床免疫效果。

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IdentificationoftypeⅠfimbriaeofEscherichiacoliisolatedfromducksandgeneticcharacteristicsoftheirFimAandFimHgenes

HUANG Shulun1， ZHENG Kaiwen1， HU Yang1， LI Zhangcheng1， CHENG Fangjun1，2，*， SONG Zhenhui1，2， ZHOU Zuoyong1，2， LIU Guolin1， LIN Chunfa1， LIN Yongrun1， ZHANG Tingting1

(1.CollegeofAnimalScience，SouthwestUniversity，Chongqing402460，China; 2.VeterinaryScienceEngineeringResearchCenterofChongqing，Chongqing402460，China)

To study the generation and molecular characteristics ofEscherichiacolitypeⅠfimbriae from ducks in parts of Sichuan-Chongqing region， the typeⅠfimbriae was identified by MSHA/MRHA test， and theirFimAandFimHgenes were identified by PCR amplification; The hydrophilicity， antigenicity， and surface probability of FimA amino acid sequences were analyzed by DNAStar to predict antigenic sites. The MSHA/MRHA test results showed that the positive rate of MSHA was 44.3%. PCR results indicated that the positive rate ofFimAandFimHwere 63.41% and 100%， respectively. Amino acid sequences of FimA and FimH were deduced and contrasted respectively with comparativeEscherichiacolistrain ECOR61 and ECOR45. Amino acid sequence alignment showed that there were 19 different positions in FimA amino acid sequences. However， there were 1-2 different positions in FimH amino acid sequences， it was believed that FimH amino acid sequences were highly conserved. The antigenic sites of FimA amino acid sequences were predicted. The results indicated that antigenic epitopes of most strains were distributed in 84-88， 142-146 and 149-150 amino acids. In addition， some other strains’ antigenic epitopes appeared at 101-105 and 130-134 amino acids.

Escherichiacoli; typeⅠfimbriae; amino acid; sequence alignment; antigenic epitope

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 1994-1999

http://www.zjnyxb.cn

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.06

2017-05-15

重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(CSTC2015SHMSZX80020)；重慶市前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究(cstc2016jcyA0235)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(XDJK2017D083)

黃書倫(1994—)，男，福建南安人，動物醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生。E-mail: 572974812@qq.com

*通信作者，程方俊，E-mail: cfj-xn@163.com

S855.3

A

1004-1524(2017)12-1994-06

(責(zé)任編輯侯春曉)