王程強，李勝聯(lián)，歐超燕，施文祥，宋家樂

(桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西桂林 541001)

·論著·

低水平母源性BDE209暴露對子鼠甲狀腺激素及甲狀腺激素脫碘酶的影響*

王程強，李勝聯(lián)，歐超燕，施文祥，宋家樂△

(桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西桂林 541001)

目的探討孕哺期低劑量十溴聯(lián)苯醚(BDE209)暴露對子代小鼠甲狀腺激素及甲狀腺激素代謝酶碘化甲狀腺氨酸脫碘酶Ⅱ(D2)的影響。方法將64只成年SPF級昆明雌鼠分為4組，受孕成功后分別經(jīng)口灌胃給予0(對照組)、50(低劑量組)、100(中劑量組)、300(高劑量組) μg·kg-1·d-1BDE209染毒處理，染毒持續(xù)至母鼠分娩后第21天。各組隨機抽取10只子鼠取外周血和大腦組織，測定外周血甲狀腺激素水平、大腦氧化損傷情況及大腦D2 mRNA表達量。結果與對照組比較，不同BDE-209劑量組的子鼠血清中總甲狀腺素(TT4)、總三碘甲腺原氨酸(TT3)、游離四碘甲腺原氨酸(FT4)和游離三碘甲腺原氨酸(FT3)水平出現(xiàn)不同程度的升高(P<0.05)；腦組織中抗氧化酶谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)活性隨著BDE209劑量增高而降低(P<0.05)，丙二醛(MDA)隨著BDE209劑量增高而升高(P<0.05)；中、高劑量組腦組織中D2 mRNA相對表達量較對照組下降(P<0.05)。結論低水平母源性BDE209暴露可導致子代小鼠甲狀腺激素水平的上升進而引起大腦氧化損傷和D2基因表達的下降。

十溴聯(lián)苯醚；甲狀腺激素類；碘化物過氧化物酶；氧化損傷

隨著阻燃劑多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)的廣泛使用，在人類、魚類等多種生物體內(nèi)及大氣、水底沉積物、土壤和室內(nèi)灰塵等外界環(huán)境中不斷有BDE209檢出，同時其濃度也在不斷升高[1-3]。作為PBDEs暴露的主要來源，環(huán)境和生物體中的BDE209在光降解、微生物降解及生物代謝等條件下可以轉化為毒性更大的BDE-47、BDE-99等低溴聯(lián)苯醚[4-6]。溴系阻燃劑因為其生物毒性正在被逐漸禁止使用，但含溴系阻燃劑的產(chǎn)品在使用、拆解和回收過程中的仍將有PBDEs的釋放和接觸，未來幾十年內(nèi)BDE209和其他PBDEs的暴露還將持續(xù)。大量研究證明，低濃度的PBDEs(BDE-47，BDE-99)可以通過干擾甲狀腺激素的轉運或降低靶組織反應能力造成甲狀腺激素水平異常進而引起神經(jīng)發(fā)育障礙等異常反應[7-8]。目前，關于BDE209對甲狀腺功能損害的研究十分有限。人群流行病學資料提示PBDEs的敏感人群主要為孕婦、嬰幼兒。而也有研究表明，母親孕期暴露PBDEs與出生兒童的神經(jīng)發(fā)育和智力障礙存在高度相關性[9]。碘化甲狀腺氨酸脫碘酶(iodothyroninedeiodinases，DI)是一組含硒整合膜蛋白，能夠調(diào)節(jié)組織細胞內(nèi)甲狀腺激素的生物活性，大腦皮層的T3主要是由星型膠質(zhì)細胞質(zhì)中的T4在碘化甲狀腺氨酸脫碘酶Ⅱ(D2)催化下生成，研究BDE209暴露下D2的活性有助于進一步揭示BDE209引起神經(jīng)發(fā)育障礙的機制。因此，本實驗通過對孕母鼠進行BDE209染毒，觀察BDE209對子鼠甲狀腺激素的干擾。

1 材料與方法

1.1動物分組及處理 成年昆明雌鼠64只(購于桂林醫(yī)學院實驗動物中心，合格證號SCXK桂2013-0001)，體質(zhì)量18～20 g，適應性飼養(yǎng)1周，按雌雄比例3∶1合籠交配，以雌鼠陰道分泌物涂片中觀察到活動的精子，作為交配成功的標志。將受孕成功的雌鼠分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。 將BDE209(純度100%，美國Sigma公司)溶于玉米油，分別給予0、50、100、300 μg·kg-1·d-1劑量BDE209灌胃處理(對照組母鼠灌胃與中劑量組等量花生油)至母鼠分娩的第21天。各劑量組選取子鼠10只(雌雄各半)，乙醚麻醉后心臟取血法取子鼠外周血，離心后取上清液，放射免疫分析法檢測血清中總四碘甲腺原氨酸(TT4)、總三碘甲腺原氨酸(TT3)、游離四碘甲腺原氨酸(FT4)和游離三碘甲腺原氨酸(FT3)水平。無菌環(huán)境下采集子鼠腦組織后將其速凍于液氮中，-80 ℃保存待用。

表1 GAPDH、D2基因引物的基本信息

表2 各組子鼠甲狀腺激素水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

1.2子鼠海馬組織氧化應激指標的檢測 取0.5 g腦組織，解凍后用預冷的4 ℃生理鹽水稀釋10倍，冰上研磨制備勻漿，3 000 r/min 離心15 min，取超濾離心后的上清液備檢，按照谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所)說明書比色法檢測GST、MDA和SOD的水平。

1.3大腦D2 mRNA表達檢測 取凍存大腦，液氮研磨后用TRIzol(北京全式金生物技術有限公司)提取總RNA,采用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳對提取RNA進行定性定量驗證；取2 μg總RNA反轉錄反應合成cDNA，反轉錄條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保存；按照TakaraSYBR Premix Ex TaqTM定量試劑盒說明書，按順序在PCR 管中加入H2O 7.2 μL、引物(10 μmol/L) 各 0.4 μL、模板2.0 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，混勻離心后在 Takara Thermal Cycler Dice TP800 PCR 儀上反應檢測，反應程序如下:預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。內(nèi)參GAPDH和D2基因引物序列見表1。使用TP800 v4.01軟件對結果進行分析，以GAPDH的表達量對結果進行標準化。

2 結 果

2.1各組子鼠甲狀腺激素水平比較 母源性BDE209暴露21 d后子鼠血清中TT4、TT3、FT4、FT3水平出現(xiàn)不同程度的升高。其中，高、中、低劑量組中TT4、TT3、FT4、FT3水平與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著劑量的增高，子鼠甲狀腺激素水平增高，見表2。

2.2各組子鼠大腦氧化應激指標比較 母源性BDE209暴露后各劑量組子代小鼠大腦組織中抗氧化酶GST、SOD活性隨著劑量增高而降低，均低于對照組(P<0.05)。而氧化應激損傷標志物MDA的水平隨著劑量增高上升顯著(P<0.05)，均高于對照組(P<0.05),見表3。

表3 各組子鼠大腦氧化應激指標比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

2.3各組子鼠大腦D2基因表達比較 母源性BDE209暴露后中、高劑量組子代小鼠大腦組織D2 mRNA相對表達量與對照組和低劑量組相比下降(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖1各組子鼠大腦D2基因表達比較

3 討 論

目前對于環(huán)境中PBDEs的暴露對生物體甲狀腺激素水平的影響存在爭議。如有研究發(fā)現(xiàn)我國萊州灣生產(chǎn)源區(qū)人體血清中較高水平的PBDEs暴露與甲狀腺激素水平顯著相關。較高暴露水平的BDE28和BDE47可以造成人體內(nèi)T3水平升高，而BDE28、BDE153、BDE183則與FT3水平之間均具有顯著的正相關[10]。而本次研究結果也發(fā)現(xiàn)孕期低劑量BDE209暴露會造成小鼠子代甲狀腺激素T3、FT3水平的升高。同樣，PBDEs暴露也會引起魚類中T4和反T3(rT3)水平的升高[11]。但一些學者也得出不同的結論，即孕期BDE209暴露導致雄性子鼠T3水平下降[12]，在人群研究中發(fā)現(xiàn)成年男性體內(nèi)BDE47和甲狀腺激素水平呈負相關[13]。而Julander等[14]和Bloom等[15]的研究則認為甲狀腺激素水平和PBDEs及其同系物水平并沒有相關性。因此，筆者認為出現(xiàn)上述不一致的原因較為復雜，可能與不同的環(huán)境暴露條件及不同種屬不同個體對PBDEs的代謝差異有關。

在本研究中，實驗用的低、中劑量(50、100 μg·kg-1·d-1)的BDE209遠低于迄今為止大多數(shù)嚙齒類動物實驗劑量，而更貼近于PBDEs在人群中實際的環(huán)境暴露劑量，更容易反映出其低水平環(huán)境的暴露特點[16-17]。而高計量(300 μg·kg-1·d-1)則主要反映食物中被環(huán)境污染后的BDE209蓄積劑量[16-17]。而本研究也發(fā)現(xiàn)，低劑量的BDE209會造成子代小鼠甲狀腺激素水平的降低。而低劑量BDE209通過母體代謝后，可能生產(chǎn)多種不同類別的代謝產(chǎn)物，如脫溴代謝產(chǎn)物、甲氧基代謝產(chǎn)物及羥基代謝產(chǎn)物等[18]。而這一類低劑量代謝產(chǎn)物可能對子鼠產(chǎn)生低劑量興奮效應，引起機體出現(xiàn)亞臨床甲狀腺功能亢進癥狀。

許多研究表明，較高的甲狀腺激素水平在介導自由基所引發(fā)的氧化損傷中起關鍵作用。甲狀腺激素異常升高會導致機體基礎代謝增加，而線粒體呼吸鏈功能紊亂則會造成大量自由基的產(chǎn)生。一旦自由基的生成量超出自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力，就會引起生物體內(nèi)有機大分子變異，進而造成細胞和組織器官的氧化損傷[19-20]，本實驗發(fā)現(xiàn)孕期低劑量BDE209暴露會造成子代小鼠腦組織中抗氧化酶GST和SOD活性隨著劑量增高而降低，而氧化應激損傷標志物MDA的水平對隨著劑量增高而顯著上升。作為機體代謝最高的器官，大腦富含脂質(zhì)，但其自身的抗氧化能力較弱，對自由基產(chǎn)生非常敏感，極易發(fā)生氧化損傷而引起自身的功能障礙。這為PBDEs導致生物體神經(jīng)發(fā)育障礙的機制研究提供了新的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，孕期低水平的BDE209暴露導致子鼠甲狀腺激素增高，引起機體出現(xiàn)亞臨床甲狀腺功能亢進癥狀。甲狀腺功能亢進除了高代謝綜合征外還有精神和神經(jīng)癥狀[21]。D2是甲狀腺激素的重要代謝酶，主要分布在腦組織中。D2的活性變化與機體甲狀腺激素的水平關系密切。而本實驗采用實時熒光定量PCR技術檢測孕期低劑量BDE209子鼠大腦D2 mRNA表達水平時發(fā)現(xiàn)，各組劑量小鼠大腦D2 mRNA表達量與對照組小鼠相比出現(xiàn)下降，這提示甲狀腺激素水平異常升高對大腦D2基因表達水平起一定的抑制作用。國外學者也得到了相似的結論，高水平甲狀腺激素抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)D2表達，甲狀腺激素降低時D2 mRNA表達增高[22]。D2能導致血液中的T4脫碘轉化成T3，適量的T3在大腦發(fā)育及生理功能中起著關鍵的作用。甲狀腺功能亢進時高水平的甲狀腺激素可導致D2 mRNA表達減少進而減少脫碘酶的生成，使腦中T3生成減少，這有助于了解BDE209暴露導致神經(jīng)發(fā)育障礙的發(fā)生機制，但其具體的發(fā)生機制還有待于進一步研究。

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TheeffectoflowdoseofBDE209onthyroidhormoneandthyroidhormonedeiodinaseinoffspringmiceafterpregnancyexposure*

WangChengqiang,LiShenglian,OuChaoyan,ShiWenxiang,SongJiale△

(SchoolofPublicHealth,GuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541004,China)

ObjectiveTo investigate the effect of low dose of BDE209 on thyroid hormone and thyroid hormone metabolism enzyme-iodothyroninedeiodinases Ⅱ(D2) in off spring mice after pregnancy exposure.MethodsTotal 64 adult SPF female Kunming mice were randomly divided into 4 groups,which treated with oral gavage of 0，50，100，300 μg·kg-1·d-1dose of BDE209 after successful pregnancy,the exposure continue to 21 days after delivery.10 mice was randomly selected in each offspring group and get the peripheral blood and brain sample,the serum thyroid hormones level,oxidative damage and the expression of D2 mRNA in brain were detected.ResultsCompared with the control group(0 μg·kg-1·d-1dose of BDE209),the TT4,TT3,FT4 and FT3 levels of offspring mice increased significantly in every exposure group(P<0.05);antioxidant enzyme glutathione-S transferees (GST),superoxide dismutase (SOD) activity decreased with the BDE209 dose increase (P<0.05),and malondialdehyde (MDA) level increased (P<0.05);the D2 mRNA relative expression of brain in middle(100 μg·kg-1·d-1dose of BDE209) and high(300 μg·kg-1·d-1dose of BDE209) dose group decreased when compared with control group(P<0.05).ConclusionLow level of BDE209 exposure in pregnancy resulted in the increasing of thyroid hormone levels in offspring mice,which may cause oxidative damage and decrease expression of D2 mRNA in the brain.

] BDE 209;thyroid hormone;Iodide peroxidase;oxidative damage

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.001

國家自然科學基金資助項目(81560530)；2016年廣西壯族自治區(qū)大學生科技創(chuàng)新項目(201610601085)。

王程強(1981-)，講師，碩士，主要從事地方醫(yī)學、公共衛(wèi)生研究?！?/p>

，E-mail:songjiale@glmc.edu.cn。

X174

A

1671-8348(2017)36-5041-03

2017-08-19

2017-09-27)