張萬(wàn)賀，寶琪，杜春陽(yáng)，郭義超

(1保定市蓮池區(qū)婦幼保健院，河北保定071000；2保定市骨科醫(yī)院；3河北醫(yī)科大學(xué))

·基礎(chǔ)研究·

鞘氨醇激酶1對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

張萬(wàn)賀1，寶琪2，杜春陽(yáng)3，郭義超2

(1保定市蓮池區(qū)婦幼保健院，河北保定071000；2保定市骨科醫(yī)院；3河北醫(yī)科大學(xué))

目的探討鞘氨醇激酶1(SphK1)對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞隨機(jī)分為四組，轉(zhuǎn)染組、Vector組分別轉(zhuǎn)染SphK1 siRNA及對(duì)照siRNA，PF-543組在培養(yǎng)液中加入1 μmol/L SphK1特異性抑制劑PF-543，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。干預(yù)48 h時(shí)，采用Western blotting法檢測(cè)SphK1蛋白表達(dá)，明確siRNA轉(zhuǎn)染可在蛋白水平抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞SphK1高表達(dá)，且效果與其抑制劑PF-543相當(dāng)。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，采用TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用Western blotting法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Bax、Bcl-2、Caspase-3及活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組、Vector組比較，轉(zhuǎn)染組、PF-543組細(xì)胞存活率均下降，細(xì)胞凋亡率均增加，PCNA、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)均減低，Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均增加，組間比較P均<0.05。結(jié)論SphK1基因可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)凋亡及增殖相關(guān)因子表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

骨肉瘤；鞘氨醇激酶1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；鞘氨醇激酶1特異性抑制劑

骨肉瘤是兒童及青少年常見(jiàn)的高度惡性骨組織原發(fā)腫瘤，年發(fā)病率為2/100萬(wàn)～5/100萬(wàn)，好發(fā)于血運(yùn)豐富的長(zhǎng)骨干骺端，具有早期肺轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，患者預(yù)后較差[1～3]。鞘氨醇激酶1(SphK1)可將具有促細(xì)胞凋亡功能的鞘氨醇(Sph)磷酸化為具有促細(xì)胞存活功能的鞘氨醇1-磷酸(S1P)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[4]。Zhou等[5]研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-124(miRNA-124)可通過(guò)下調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞SphK1表達(dá)抑制細(xì)胞增殖及侵襲；苯妥帝爾和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制骨肉瘤組織SphK1高表達(dá)，同時(shí)抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育[6]。上述研究結(jié)果提示，SphK1可能參與骨肉瘤的發(fā)病及其病理生理過(guò)程，但其作用機(jī)制尚不明確。2016年3月～2017年3月我們進(jìn)行本研究，探討SphK1對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。SphK1 siRNA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。SphK1特異性抑制劑PF-543購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司。兔抗SphK1、Bcl-2、Caspase-3、活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)多克隆抗體及小鼠抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。MTT購(gòu)自Sigma公司。脂質(zhì)體2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購(gòu)自美國(guó)Milipore公司。TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將U2OS細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)基中37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合75%～85%時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，進(jìn)行以下研究。

1.3 細(xì)胞分組處理 將細(xì)胞隨機(jī)分為四組，其中轉(zhuǎn)染組、Vector組分別采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染SphK1 siRNA及對(duì)照siRNA，PF-543組在培養(yǎng)液中加入1 μmol/L SphK1特異性抑制劑PF-543，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 細(xì)胞SphK1蛋白表達(dá) 采用Western blotting法檢測(cè)。將四組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用冰冷PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液200 μL，冰上放置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，取上清液置于一干凈的EP管中，Lowry法測(cè)定總蛋白濃度。取細(xì)胞裂解蛋白50 μg，行SDS-PAGE電泳，將產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入SphK1抗體，4 ℃冰箱過(guò)夜；TBST液洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔抗體，37 ℃孵育1.5 h；TBST液洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY遠(yuǎn)紅外雙色熒光成像系統(tǒng)顯影(LLCOR Gene Company，USA)。LabWorks4.5軟件(UVP Company，USA)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.4.2 細(xì)胞增殖情況 采用MTT法檢測(cè)。將細(xì)胞(5×103個(gè)/mL)接種于96孔板，每孔定容為200 μL，分別加入200 μL(5 g/L)MTT，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)液，每孔分別加入150 μL DMSO，待結(jié)晶完全溶解；采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(處理組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4.3 細(xì)胞凋亡率 ①采用TUNEL法檢測(cè)。將細(xì)胞(6×103個(gè)/mL)接種于8孔Leb-Tak腔室波片(美國(guó)Nalge Nunc公司)采用TUNEL法檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞。步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色。每孔至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。②采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗兩次，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的冰冷乙醇固定24 h，置于4 ℃冰箱；取出后PBS沖洗兩次，碘化丙啶4 ℃避光染色30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 采用Western blotting法檢測(cè)。具體步驟參照1.4.1。

2 結(jié)果

2.1 各組SphK1蛋白表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染組、Vector組、PF-543組、對(duì)照組SphK1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.16±0.03、0.91±0.02、0.32±0.01、0.98±0.02。轉(zhuǎn)染組、PF-543組SphK1蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組及Vector組明顯降低(P均<0.05)，其余組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 各組細(xì)胞存活率比較 轉(zhuǎn)染組、Vector組、PF-543組、對(duì)照組細(xì)胞存活率分別為(45.17±0.21)%、(92.00±0.02)%、(53.05±0.26)%、(98.04±0.01)%。與對(duì)照組、Vector組比較，轉(zhuǎn)染組、PF-543組細(xì)胞存活率均下降(P均<0.01)；其余組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組、Vector組、PF-543組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(54.81±0.15)%、(8.20±0.03)%、(47.31±0.16)%、(2.57±0.02)%。與對(duì)照組及Vector組比較，轉(zhuǎn)染組、PF-543組細(xì)胞凋亡率均升高(P均<0.01)；其余組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

TUNEL結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組、Vector組、PF-543組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(47.32±0.16)%、(4.35±0.05)%、(41.13±0.41)%、(4.82±0.06)%。與對(duì)照組和Vector組比較，轉(zhuǎn)染組、PF-543組細(xì)胞凋亡率均升高(P均<0.01)；其余組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.4 各組PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組和Vector組比較，轉(zhuǎn)染組、PF-543組PCNA、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，組間比較P均<0.05。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及 cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與Vector組比較，*P<0.01。

3 討論

80%的骨肉瘤患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)及新輔助化療后5年生存率僅20%～30%[7,8]。骨肉瘤臨床治療效果不佳的重要原因是缺少特異性的分子治療靶點(diǎn)[9]。SphK1是維持細(xì)胞內(nèi)鞘脂平衡的重要調(diào)節(jié)酶，具有SphK1和SphK2兩個(gè)亞型，雖然二者在結(jié)構(gòu)域上高度保守，但在亞細(xì)胞定位、酶催化特性和組織表達(dá)譜等方面均顯著不同。SphK1是1-磷酸鞘氨醇(S1P)生成的限速酶，通過(guò)降低組織內(nèi)神經(jīng)酰胺和鞘氨醇含量，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[3]。研究發(fā)現(xiàn)，SphK1在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于正常組織，如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌及甲狀腺癌等[10,11]。Bonhoure等[12]報(bào)道，特異性敲除人類(lèi)白血病細(xì)胞系SphK1基因能夠抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Heffernan-Stroud等[13]報(bào)道，敲除SphK1基因可以抑制p53基因敲除小鼠特征性胸腺淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展。SphK1表達(dá)水平與腫瘤惡性程度和患者預(yù)后等臨床病理特征相關(guān)，因此SphK1被認(rèn)為是生物體內(nèi)重要的致癌因子。新近有報(bào)道稱，SphK1參與骨肉瘤的發(fā)病及其病理生理過(guò)程。彭晶等[4]研究發(fā)現(xiàn)，mi-124通過(guò)下調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞SphK1表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖及侵襲。苯妥帝爾和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用同樣能夠抑制骨肉瘤組織SphK1高表達(dá)，進(jìn)而抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。本研究采用短鏈microRNA和特異性抑制劑兩種手段敲低人骨肉瘤U2OS細(xì)胞SphK1表達(dá)，結(jié)果顯示，SphK1表達(dá)被抑制后U2OS細(xì)胞增殖受到明顯抑制，提示SphK1基因可能是骨肉瘤的靶基因。

腫瘤防治的關(guān)鍵是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞接受內(nèi)外源死亡信號(hào)刺激后發(fā)生的自殺性死亡，在調(diào)節(jié)生物生長(zhǎng)發(fā)育和自身穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。目前臨床上大多數(shù)抗腫瘤藥物的作用機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，SphK1在許多哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[14]。有研究以病毒為載體，將野生型和突變型SphK1基因?qū)肴宋赴┘?xì)胞，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SphK1可抑制5-FU誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡[14]；干擾乳腺癌MCF-7細(xì)胞SphK1基因表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，SphK1表達(dá)被抑制后骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡率升高，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，促凋亡發(fā)生基因Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯升高。提示在骨肉瘤發(fā)病過(guò)程中，SphK1基因通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。PCAN及Cyclin D1是細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其在腫瘤組織中的表達(dá)變化對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后具有關(guān)鍵性評(píng)估價(jià)值。本研究中SphK1表達(dá)被抑制后骨肉瘤U2OS細(xì)胞PCNA及Cyclin D1表達(dá)均受到明顯抑制，提示SphK1基因可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖因子表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，SphK1基因具有促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用；調(diào)節(jié)凋亡及增殖相關(guān)因子表達(dá)可能是其作用機(jī)制。SphK1基因可能成為骨肉瘤的治療靶點(diǎn)。

[1] 閆抗,夏斯龍,王業(yè)華.丙戊酸鈉與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS 增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制[J].山東醫(yī)藥,2016,56(3):11-13.

[2] Ren X, Shen Y, Zheng S, et al. miR-21 predicts poor prognosis in patients with osteosarcoma[J]. Br J Biomed Sci, 2016,73(4):158-162.

[3] Brown HK, Tellez-Gabriel M, Heymann D. Cancer stem cells in osteosarcoma[J]. Cancer Lett, 2017(386):189-195.

[4] 彭晶,蘭天,黃凱鵬,等.黃連素調(diào)節(jié)鞘氨醇激酶-1-磷酸鞘氨醇信號(hào)通路抗糖尿病小鼠腎損傷的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011,27(11):1544-1549.

[5] Zhou Y, Han Y, Zhang Z, et al. MicroRNA-124 upregulation inhibits proliferation and invasion of osteosarcoma cells by targeting sphingosine kinase 1[J]. Hum Cell, 2017,30(1):30-40.

[6] Yao C, Wu S, Li D, et al. Co-administration phenoxodiol with doxorubicin synergistically inhibit the activity of sphingosine kinase-1(SphK1), a potential oncogene of osteosarcoma, to suppress osteosarcoma cell growth both in vivo and in vitro[J]. Mol Oncol, 2012,6(4):392-404.

[7] Zhang N, Xie T, Xian M, et al. SIRT1 promotes metastasis of human osteosarcoma cells[J]. Oncotarget, 2016,7(48):79654-79669.

[8] Heymann MF, Brown HK, Heymann D. Drugs in early clinical development for the treatment of osteosarcoma[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2016,25(11):1265-1280.

[9] Lettieri CK, Appel N, Labban N, et al. Progress and opportunities for immune therapeutics in osteosarcoma[J]. Immunotherapy, 2016,8(10):1233-1244.

[10] Shida D, Inoue S, Yoshida Y, et al. Sphingosine kinase 1 is upregulated with lysophosphatidic acid receptor 2 in human colorectal cancer[J]. World J Gastroenterol, 2016,22(8):2503-2511.

[11] Li J, Song Z, Wang Y, et al. Overexpression of SphK1 enhances cell proliferation and invasion in triple-negative breast cancer via the PI3K/AKT signaling pathway[J]. Tumour Biol, 2016,37(8):10587-10593.

[12] Bonhoure E, Lauret A, Barnes DJ, et al. Sphingosine kinase-1 is a downstream regulator of imatinib-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia cells[J]. Leukemia, 2008,22(5):971-979.

[13] Heffernan-Stroud LA, Helke KL, Jenkins RW, et al. Defining a role for sphingosine kinase 1 in p53-dependent tumors[J]. Oncogene, 2012,31(9):1166-1175.

[14] Li PH, Wu JX, Zheng JN, et al. A sphingosine kinase-1 inhibitor, SKI-Ⅱ, induces growth inhibition and apoptosis in human gastric cancer cells[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(23):10381-10385.

[15] Sarkar S, Maceyka M, Hait NC, et al. Sphingosine kinase 1 is required for migration, proliferation and survival of MCF-7 human breast cancer cells[J]. Asian Pac FEBS Lett, 2005,579(24):5313-5317.

[16] Mahajan-Thakur S, Bien-M?ller S, Marx S, et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) signaling in glioblastoma multiforme-A systematic review[J]. Int J Mol Sci, 2017,18(11):pii: E2448.

河北省教育廳青年基金項(xiàng)目(QN2016018)。

寶琪(E-mail: 13731697766@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.008

R738.1

A

1002-266X(2017)48-0028-03

2017-06-26)