轉Bt基因海島棉分子檢測及抗蟲性鑒定

賈莉莉+范李萍+李娟+陳全家+張海燕+王希東+曲延英

摘要： 海島棉作為新疆特有的資源，其優(yōu)良的纖維品質和商業(yè)價值都是其他作物不可替代的，因此選育抗性優(yōu)良的海島棉新品系（品種）顯得尤為重要。以海島棉K222、新海25、新海30為受體，利用農(nóng)桿菌介導技術導入目的基因Bt，通過PCR檢測、Southern雜交、Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測、抗蟲性鑒定等，隨后又對轉Bt基因海島棉品系的纖維品質進行考察，發(fā)現(xiàn)目的基因Bt的導入對9個海島棉品系的纖維品質有不同程度的影響。PCR檢測結果表明，9個轉Bt基因品系都含有目的基因，并且陽性率都在90%以上；由Southern雜交結果可看出，7個轉Bt基因品系出現(xiàn)了雜交條帶，其中3個品系為單拷貝，3個品系為雙拷貝，1個品系為三拷貝。用Bt-Cry1Ab/1Ac免疫試紙條檢測轉Bt基因品系及對照，發(fā)現(xiàn)轉Bt基因品系的試紙條上出現(xiàn)2條紫紅色條帶，而對照的試紙條上只出現(xiàn)1條紫紅色條帶，K2-ZKC66 的陽性率達到90%?？瓜x性鑒定結果表明，轉Bt基因品系的葉片受危害較輕，葉片較為完整，對照葉片受危害較重，葉片不完整，7個轉Bt基因抗蟲棉品系校正死亡率都在60%以上。與對照相比，部分轉Bt基因海島棉品系上半部平均長度和長度整齊度顯著降低，斷裂比強度極顯著降低，斷裂伸長率極顯著增加，短纖維率顯著增加，成熟度極顯著降低，馬克隆值極顯著增加。結果顯示，7個轉Bt基因品系的目的基因已成功整合到海島棉基因組中。與對照相比，轉基因品系纖維品質差異顯著。

關鍵詞： 轉基因技術；海島棉；；Bt基因；抗蟲性；纖維品質；生物育種

中圖分類號： Q785；S562.03 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0097-05

轉基因是一項新技術，轉基因技術是一項新的產(chǎn)業(yè)。自1983年世界上第一例轉基因植物煙草問世以來[1]，對轉基因作物的抗蟲、抗除草劑、抗病及品質改良方面的研究與應用取得了巨大進展[2-4]。1996—2014年，全球轉基因作物的種植面積從170萬hm2增至1.815億hm2，增加了100多倍，轉基因農(nóng)作物成為全球推廣種植最為迅速的作物，這也使轉基因技術成為近代史上發(fā)展最快的作物改良技術。美國是全球轉基因作物種植的第一大國，種植的轉基因作物包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜、紫苜蓿、木瓜和南瓜等，其中棉花、大豆和玉米種植面積較廣。我國是世界上率先研究農(nóng)業(yè)生物育種的國家之一，轉基因育種的面積也一直位居世界前列，棉花是我國主要的經(jīng)濟作物，在我國國民經(jīng)濟發(fā)展中具有舉足輕重的地位[5]。近年來，隨著基因工程技術的不斷發(fā)展，利用生物技術創(chuàng)新棉花種質資源和培育新品種是一條非常有效的途徑，極大地推動了棉花遺傳育種的發(fā)展[6]。我國轉基因抗蟲棉作為生物育種創(chuàng)新成功的典范在國際上產(chǎn)生了深遠的影響，將Bt基因轉入到棉花中后，可以使棉花表達殺蟲蛋白，從而能殺死目標害蟲進而可以減少殺蟲劑的使用[7-9]，抗蟲棉的種植與推廣在一定程度上降低了棉鈴蟲對棉花產(chǎn)量的影響，給棉花產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟效益。隨著轉Bt基因抗蟲棉的長期種植，陸地棉抗蟲性得到了很大提高[10-13]。但是新疆特有的海島棉轉基因抗蟲性研究卻相對落后，至今仍未有轉基因抗蟲海島棉品系的報道。本試驗利用前期通過農(nóng)桿菌介導獲得的轉基因海島棉品系（品種）開展PCR檢測及Southern雜交等室內分子檢測，以及大田Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測與室內抗蟲性鑒定等，分析目的基因Bt轉入受體及表達的情況，為培育新疆地區(qū)抗蟲優(yōu)良的海島棉品種（品系）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料是由新疆農(nóng)業(yè)大學生物技術重點實驗室前期采用農(nóng)桿菌介導法將外源基因Bt導入海島棉K222、新海25和新海30，經(jīng)過多代系統(tǒng)選育得到的高代轉基因材料[14-15]。目的基因Bt是由郭三堆研究員惠贈，現(xiàn)由新疆農(nóng)業(yè)大學生物技術重點實驗室保存，Bt基因植物表達載體是由新疆農(nóng)業(yè)大學生物技術重點實驗室構建的。本試驗所用的品種（品系）為海島棉K222（對照）及其轉Bt基因的7個品系（K2-ZKC31、K2-ZKC37、K2-ZKC53、K2-ZKC58、K2-ZKC65、K2-ZKC66、K2-ZKC70），新海25（對照）及其轉Bt基因的XH25-ZKC和新海30（對照）及其轉Bt基因的XH30-ZKC。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR檢測及Southern雜交

實驗室內種植待檢測樣品，苗期取樣，采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）提取棉花基因組DNA，PCR擴增體系為25 μL，引物序列上游為5′-CAACGGTTCCGCTCTTTCTG-3′，下游為5′-CGTGGTTCTGCCCAAGGTAT-3′，擴增程序為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min，共35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，再用溴化乙錠染色10 min，凝膠成像儀拍照。根據(jù)擴增條帶的有無，可以初步判斷轉基因品系。

利用Southern雜交技術檢測目的基因是否整合到棉花基因組中及其拷貝數(shù)。取20 μg DNA，用HindⅢ于37 ℃酶切 6 h，35 V電泳至彌散條帶后轉印于尼龍膜，按照Roche公司的PCR DIG Probe Synthesis Kit說明進行探針標記、雜交和顯色處理。

1.2.2 Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測

Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條能快速、定性檢測轉基因植株中是否含有特異性的 Bt-Cry1Ab、Bt-Cry1Ac蛋白。采用美國Agdia公司生產(chǎn)的免疫檢測試紙條檢測。首先采集PCR呈陽性植株葉片，按照試紙條檢測說明書進行規(guī)范操作，若結果顯示2條紫紅色條帶，1條為質控線，另1條為檢測線則為陽性品系；若結果只有1條紫紅色條帶則為非轉基因品系（品種）；若試紙條未出現(xiàn)任何1條條帶，則操作有誤，應重新操作。根據(jù)是否出現(xiàn)2條紫紅色條帶，確定轉基因材料的株數(shù)，計算陽性率。

1.2.3 棉鈴蟲飼喂檢測

棉鈴蟲由中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所惠贈，蟲齡包括2、3、4齡。采集大小一致陽性植株的幼嫩葉片放入培養(yǎng)皿中，葉柄一端用浸濕的脫脂棉包裹，每張葉片接5頭蟲，用塑料膜包裹培養(yǎng)皿，放入室內培養(yǎng)。5 d 后觀察葉片受危害情況，計算幼蟲校正死亡率。

幼蟲校正死亡率=（處理幼蟲死亡率-對照幼蟲死亡率）/（1-對照幼蟲死亡率）×100%?？瓜x性評判標準：校正死亡率>90%，高抗；60%<校正死亡率≤90%，抗?。?0%<校正死亡率≤60%，中抗；校正死亡率≤40%，感病。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 轉Bt基因品系的分子檢測結果分析

2.1.1 PCR檢測結果分析

對轉Bt基因品系及對照進行DNA提取，PCR擴增，以非轉基因品種K222、新海25和新海30為陰性對照，以含有目的片段的質粒為陽性對照，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和拍照分析。由圖1、圖2可以看出，樣品均有特異性條帶，且與陽性對照質粒條帶大小一致，均在 400 bp 左右，而陰性對照沒有擴增出目的條帶，因此可初步判斷目的基因存在于棉花中。

2.1.2 Southern雜交結果分析

為進一步驗證轉Bt基因品系的目的基因是否整合到棉花基因組中以及拷貝數(shù)，分別對PCR檢測得到的陽性植株進行Southern Blotting分析（圖3）。結果表明，在9個轉基因品系中，7個轉基因品系出現(xiàn)了雜交帶，陽性質粒出現(xiàn)了雜交帶，陰性對照沒有出現(xiàn)雜交帶；3、4、6、7、9、11和13泳道出現(xiàn)了雜交帶，分別是K2-ZKC31、K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC70、K2-ZKC66、XH25-ZKC和XH30-ZKC，并且4、7和13顯示為雙拷貝，對應的品系名稱分別是K2-ZKC37、K2-ZKC70和XH30-ZKC；3、6和9顯示為單拷貝，對應的品系分別是K2-ZKC31、K2-ZKC65和K2-ZKC66；11（XH25-ZKC）顯示為三拷貝；2、10和12是陰性對照，都未出現(xiàn)雜交帶，通過以上結果可以證明，7個轉基因品系的目的基因已經(jīng)整合到海島棉基因組中。

2.2 Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測結果分析用Bt免疫試紙條檢測轉Bt基因品系，陽性結果在檢測試劑條上出現(xiàn)2條紫紅色條帶，1條為檢測線，另1條為質控線，陰性結果只含有1條紫紅色質控線（圖4）。經(jīng)過Bt免疫試紙條檢測后，其中圖4-A出現(xiàn)了2條紫紅色的條帶，為轉Bt基因品系，圖4-B只出現(xiàn)了1條紫紅色條帶，為非轉Bt基因品系。由Bt免疫試紙條統(tǒng)計結果（表1）可以看出，K2-ZKC66 的陽性率達到90%，其他（除K2-ZKC53和 K2-ZKC58 以外）轉Bt基因品系的陽性率略低，在30%～60%之間。

2.3 轉Bt基因品系抗蟲性檢測結果分析

棉葉接蟲5 d后，由圖5可以看出，轉基因抗蟲棉葉片受棉鈴蟲危害較輕，整個葉片也較為完整，而對照組葉片受棉鈴蟲危害較重，整張葉片只剩下1/3，說明抗蟲棉能減緩棉鈴蟲對葉片的危害。由轉Bt基因抗蟲棉抗蟲性鑒定結果（表2）可看出，7個轉Bt基因抗蟲棉品系幼蟲校正死亡率都在60%以上，其中K2-ZKC31、K2-ZKC66和K2-ZKC70的棉鈴蟲幼蟲校正死亡率在80%及其以上；XH25-ZKC和XH30-ZKC的幼蟲校正死亡率相對較低，均為66%。由幼蟲校正死亡率可以得到轉Bt基因海島棉的抗性級別，除K2-ZKC53和 K2-ZKC58外，其他轉Bt基因品系抗性為抗。

2.4 轉基因品系纖維品質與對照比較分析

由表3可知，K2-ZKC37、K2-ZKC65和K2-ZKC66的上半部平均長度、長度整齊度極顯著低于對照，K2-ZKC70的上半部平均長度、長度整齊度顯著低于對照；K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC66和K2-ZKC70的斷裂比強度極顯著低于對照；K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC66的斷裂伸長率極顯著低于對照； K2-ZKC65、K2-ZKC66和K2-ZKC70的短纖維率極顯著高于對照，K2-ZKC37的短纖維率顯著高于對照；K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC66成熟度極顯著高于對照；K2-ZKC58和K2-ZKC70的馬克隆值極顯著高于對照。XH25-ZKC與XH25、XH30-ZKC與XH30的纖維品質無顯著差異，都保持著原品系的性狀，可以說明Bt基因導入XH25和XH30，沒有改變它們的纖維品質。

3 討論

PCR檢測可以證明待測樣品中是否含有目的條帶，但會因引物設計不合理以及目的基因在受體中重排等原因使PCR檢測出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，所以還需要進一步進行Southern雜交檢測，它是在DNA水平上檢測目的基因是否整合到受體染色體上的技術。符家平等對轉Bt基因苧麻T0和T1代分子檢測，結果顯示PCR檢測呈陽性的T0和T1代植株做Southern雜交都得到了單一雜交條帶，表明外源基因片段轉入到受體中[16]。本試驗中，PCR檢測轉Bt基因品系擴增出目的條帶，可初步判斷Bt基因轉到了受體中，在進一步的Southern 雜交檢測中，7個轉基因品系得到雜交條帶，可以證明這7個轉基因品系的目的基因已經(jīng)整合到海島棉基因組中，已獲得的雜交條帶的拷貝數(shù)有單拷貝、雙拷貝和三拷貝等3種，檢測的轉基因品系中三拷貝的有1個，僅占14%，說明轉基因品系的遺傳穩(wěn)定性較高。本研究所用轉基因品系均是通過農(nóng)桿菌介導法獲得的，農(nóng)桿菌介導過程中根癌農(nóng)桿菌是以低拷貝數(shù)整合到棉花基因組中的，而質粒注射往往以多拷貝數(shù)整合到棉花基因組中[17]。李瓊等利用農(nóng)桿菌噴霧和質粒注射處理后代植株，Southern雜交得出農(nóng)桿菌噴霧的平均單插入率高于質粒注射，農(nóng)桿菌噴霧法也能轉化后代并且穩(wěn)定性較高[18]。

Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條可以定性檢測Bt毒蛋白。聶新輝等使用金標Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測轉Bt基因棉花，得出轉Bt基因棉花的試紙條上出現(xiàn)2條紫紅色條帶，說明轉Bt基因棉花中含有Bt毒蛋白[19]。本試驗中，K222轉Bt基因的部分品系以及XH25-ZKC和XH30-ZKC的試紙條檢測結果出現(xiàn)了2條紫紅色的條帶，可以說明部分轉基因品系中含有Bt毒蛋白。寧新民等用試紙條檢測外源抗蟲基因時，得出海島棉檢測線的清晰度比陸地棉低[20]，本試驗結果與其有相似之處，這可能與外源基因轉入量有關或者與海島棉抗蟲基因的蛋白質表達量有關[21-23]。

抗蟲性鑒定是在蛋白水平檢測轉Bt基因棉花。徐遙等所做棉鈴蟲的抗性試驗報道得出Bt棉對棉鈴蟲有毒殺作用[24-26]。本試驗中，轉基因品系葉片相對非轉基因品系（品種）葉片較完整，危害較輕，說明轉基因Bt棉能減緩棉鈴蟲對葉片的危害。李瑞奇等做轉基因棉花抗蟲性鑒定試驗發(fā)現(xiàn)，3代棉鈴蟲的校正死亡率和抗性都低于2代棉鈴蟲，并且隨著棉株生育期的進展，棉株對棉鈴蟲的抗性明顯降低[27]。王峰等做抗蟲性鑒定試驗得出，在2、3、4齡，棉鈴蟲發(fā)生盛期，陽性植株葉片對棉鈴蟲校正死亡率依次降低，植株的抗蟲性隨著植株的生長表現(xiàn)降低的趨勢[28]。本試驗幼蟲校正死亡率大部分處于60%～85%之間，抗性級別處于抗，原因可能與采取棉株葉片時間、棉鈴蟲的齡數(shù)有關。

將Bt基因導入棉花后，棉花農(nóng)藝性狀會發(fā)生一系列變化，其纖維品質是非常重要的農(nóng)藝性狀，纖維品質的優(yōu)劣直接影響其經(jīng)濟價值和紡織工業(yè)。因為轉Bt基因海島棉研究較少，所以前人都是以陸地棉為受體研究Bt基因導入后農(nóng)藝性狀的改變[29-30]，得出Bt基因導入棉花后，長度下降，強度提高，伸長率下降，馬克隆值升高[31]；轉Bt基因品系中部分品種上半部平均長度、整齊度、斷裂比強度、伸長率等高于非轉基因品種[32]；轉Bt+Sck基因導入對棉花纖維品質無顯著影響[33]；轉基因抗蟲棉的絨長下降、比強度不同程度增加以及纖維增粗[34]。其他目的基因導入陸地棉后，其纖維品質也發(fā)生不同程度的改變，轉基因棉花絨長和比強度不同程度增加，馬克隆值降低[35]；纖維長度及比強度下降、成熟度降低等[36]；轉基因棉花纖維品質整體比受體顯著提高[37]。本研究將Bt基因導入海島棉后，其纖維品質發(fā)生的改變，填補了Bt基因導入對海島棉農(nóng)藝性狀研究的空白。在本研究中，與對照相比，部分轉Bt基因海島棉品系上半部平均長度和長度整齊度顯著降低、斷裂比強度極顯著降低、斷裂伸長率極顯著增加、短纖維率顯著增加、成熟度極顯著降低和馬克隆值極顯著增加，但也有個別品系的纖維品質略高于對照。由于地區(qū)、材料以及數(shù)據(jù)處理之間的差異等造成轉基因與對照之間纖維品質結果的不同，同一品種的不同株系間也會因性狀分離使纖維品質表現(xiàn)出差異。

4 結論

以海島棉K222、新海25、新海30為受體，利用農(nóng)桿菌介導技術導入目的基因Bt，通過PCR檢測、Southern雜交、Bt-Cry1Ab/1Ac 試紙條檢測、抗蟲性鑒定等，證明Bt基因已經(jīng)整合到海島棉基因組中并得到表達。與對照相比，部分轉Bt基因海島棉品系上半部平均長度和長度整齊度顯著降低、斷裂比強度極顯著降低、斷裂伸長率極顯著增加、短纖維率顯著增加、成熟度極顯著降低和馬克隆值極顯著增加，但也有個別品系的纖維品質略高于對照。

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