李偉+郭君潔+李鴻雁

摘要： 以羽衣甘藍(lán)名古屋品種（Brassica oleracea L. var. acephala f. tricolor Hort.）為研究材料，在100 mmol/L NaCl脅迫下，分別使用外源H2O2和H2O2清除劑二甲基硫脲處理。2 d后測(cè)定植物的生長(zhǎng)速率、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量和相對(duì)含水量，6 h后測(cè)定植株體內(nèi)3個(gè)抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性及基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，鹽脅迫下加入0.05 mmol/L外源H2O2，羽衣甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)速率、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、相對(duì)含水量、3個(gè)抗氧化防護(hù)酶的活性和基因表達(dá)分別高于鹽脅迫下相關(guān)指標(biāo)；清除內(nèi)源H2O2，則植物幼苗生長(zhǎng)速率、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量和相對(duì)含水量、3個(gè)抗氧化防護(hù)酶的活性及基因表達(dá)分別低于鹽脅迫下相關(guān)指標(biāo)。由此推測(cè)，在鹽脅迫條件下，H2O2參與了抗氧化防護(hù)基因表達(dá)的調(diào)控，它可能是鹽脅迫誘導(dǎo)的羽衣甘藍(lán)葉片抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的重要調(diào)控因子。

關(guān)鍵詞： 羽衣甘藍(lán)；H2O2；鹽脅迫；抗氧化酶；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S635.901 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0149-04

鹽脅迫是造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)最常見的逆境條件，提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性，尤其是對(duì)鹽脅迫的抗性，是穩(wěn)定植物生長(zhǎng)的首選目標(biāo)，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，包括過氧化（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）、羥自由基（·OH）、超氧陰離子（O-2[KG-*2]· ）、脂質(zhì)過氧基（ROO·）等[1-4]。鹽脅迫能迅速誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧的積累，對(duì)蛋白質(zhì)和脂類引起氧化損傷[5]。而植物體內(nèi)有2種清除保護(hù)機(jī)制，即酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，其中酶促系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等。研究表明，鹽脅迫能使植物體內(nèi)活性氧增高[6-8]。近年來，許多試驗(yàn)表明，H2O2是一種重要的信號(hào)分子，當(dāng)植物細(xì)胞在響應(yīng)于各種脅迫反應(yīng)時(shí)能生成該物質(zhì)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9-14]。有證據(jù)顯示，逆境條件下內(nèi)源H2O2積累能增加植物的抗逆性，過量的H2O2等ROS能引起細(xì)胞內(nèi)大分子氧化損傷；Wahid等的研究表明，過氧化氫預(yù)處理可以使細(xì)胞膜系統(tǒng)保持完整，繼而提高小麥種子抗氧化能力，增強(qiáng)小麥在萌發(fā)過程中的耐鹽性[13]。在植物的抗鹽反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用的SOS1（salt overly sensitive）是擬南芥Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，H2O2能調(diào)節(jié)其mRNA穩(wěn)定性。然而，在鹽脅迫誘導(dǎo)下，H2O2與氧化酶活性其表達(dá)機(jī)理尚不十分清楚。

本試驗(yàn)研究鹽脅迫下外源H2O2或者清除體內(nèi)H2O2對(duì)羽衣甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)特性、抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在揭示H2O2在植物抗鹽脅迫反應(yīng)中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年8—10月在黃淮學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選用羽衣甘藍(lán)名古屋品種（Brassica oleracea L. var acephala f. tricolor Hort.） 為研究材料，由駐馬店市南海公園提供。H2O2供體為30% H2O2，H2O2清除劑為二甲基硫脲，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)處理

把羽衣甘藍(lán)種子，消毒后，用蒸餾水沖洗數(shù)次，濾紙吸干。處理后的種子放入墊好濾紙的培養(yǎng)皿中，溫室培養(yǎng)[溫度：（24±2） ℃，光照—黑暗：16 h—8 h，光照度：2 000 lx]。待羽衣甘藍(lán)胚根長(zhǎng)3～5 mm時(shí)，選取胚根整齊一致的幼苗，盆栽。待苗長(zhǎng)至10 cm左右，放入Hoagland溶液溫室預(yù)培養(yǎng)3 d。3 d 后，分4組進(jìn)行處理，分別是對(duì)照組（CK）：Hoagland溶液；鹽處理組（N）：100 mmol/L NaCl+Hoagland溶液；NaCl+H2O2組（N+H）：100 mmol/L NaCl+0.05 mmol/L H2O2+Hoagland溶液；NaCl+DMTU組（N+DMTU）：100 mmol/L NaCl+5 mmol/L DMTU+Hoagland溶液。處理6 h后，進(jìn)行SOD、CAT、APX活性分析與基因（SOD，GenBank：JQ321587.1；CAT，GenBank：JF720325.1；APX，GenBank：XM_013733887.1）表達(dá)測(cè)定。用異硫酸胍法提取葉片內(nèi)總RNA，ABI7700進(jìn)行定量PCR，以actin（GenBank登錄號(hào)AF111812.1）作為內(nèi)參（表1），方法參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。每處理重復(fù)3次，為了保持處理一致性，處理期間每天更換處理液，處理48 h后，分別取羽衣甘藍(lán)幼苗測(cè)定生長(zhǎng)速率，取葉片分別測(cè)定干質(zhì)量、鮮質(zhì)量和相對(duì)含水量，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下外源或清除內(nèi)源H2O2對(duì)羽衣甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，用50 mmol/L NaCl處理的羽衣甘藍(lán)幼苗與對(duì)照沒有顯著差異，僅有部分老葉枯萎。在100 mmol/L NaCl脅迫下，羽衣甘藍(lán)幼苗受傷害程度增加，上部部分葉片變黃，下部老葉萎蔫。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到150、200 mmol/L時(shí)，葉片嚴(yán)重失水，導(dǎo)致甘藍(lán)幼苗全株死亡。因此，在此后試驗(yàn)中，選擇100 mmol/L NaCl進(jìn)行處理。在此濃度下，羽衣甘藍(lán)幼苗表現(xiàn)出一定的鹽害癥狀，但不會(huì)導(dǎo)致植物死亡。預(yù)試驗(yàn)表明，H2O2濃度為0.05 mmol/L時(shí)對(duì)100 mmol/L NaCl脅迫下羽衣甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)的影響較為明顯，因此本試驗(yàn)H2O2濃度為005 mmol/L。

用100 mmol/L NaCl處理羽衣甘藍(lán)幼苗的生長(zhǎng)受到顯著抑制，植株生長(zhǎng)速率、植株地上部鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和相對(duì)含水量與對(duì)照相比均下降，且有顯著差異。外源H2O2使鹽脅迫羽衣甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)速度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和相對(duì)含水量與僅鹽脅迫處理顯著增加（圖1）。在鹽脅迫下，用H2O2清除劑DMTU處理，則葉片生長(zhǎng)速率、植株鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和相對(duì)含水量與鹽脅迫下相比顯著下降，表明清除H2O2后，鹽脅迫下羽衣甘藍(lán)生長(zhǎng)受到抑制。endprint

2.2 鹽脅迫下外源H2O2或清除內(nèi)源H2O2對(duì)幾種抗氧化酶活性的影響

當(dāng)植物體處在脅迫環(huán)境中時(shí)，抗氧化酶活性通常會(huì)增加，以加強(qiáng)對(duì)逆境的適應(yīng)。在100 mmol/L NaCl脅迫條件，羽衣甘藍(lán)幼苗SOD酶活性顯著上升，與對(duì)照相比有顯著差異，外源0.05 mmol/L H2O2處理與鹽脅迫相比可以顯著提高SOD酶活性（圖2）。說明低濃度外源H2O2能增強(qiáng)抗氧化酶活性。CAT和APX與SOD類似。

2.3 鹽脅迫下外源H2O2或清除內(nèi)源H2O2對(duì)幾種氧化酶基因表達(dá)的影響

與對(duì)照相比，鹽脅迫條件下，3個(gè)基因的表達(dá)均有所增加，且SOD、CAT、APX基因表達(dá)增加的趨勢(shì)相同。加入外源H2O2，3種基因表達(dá)量有所提高，與對(duì)照有顯著差異。當(dāng)用H2O2清除劑對(duì)鹽脅迫下羽衣甘藍(lán)的3個(gè)抗氧化防護(hù)基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，3種基因的表達(dá)量與鹽脅迫相比有所下降，差異顯著（圖3）。

3 討論

當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧代謝平衡失調(diào)，積累的活性氧導(dǎo)致鹽害[17-18]。因此，本研究中，高濃度的H2O2處理，引起羽衣甘藍(lán)幼苗活性氧增加，對(duì)鹽脅迫適應(yīng)性下降，使植物受害加重，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。近年研究表明，H2O2等活性氧在植物體內(nèi)也能起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，微量過氧化氫等活性氧在調(diào)節(jié)某些生理現(xiàn)象方面起著重要作用，尤其是在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。本試驗(yàn)中采用的0.05 mmol/L濃度H2O2在羽衣甘藍(lán)響應(yīng)鹽脅迫過程中可能發(fā)揮了某種信號(hào)作用，參與或者影響了鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而一定程度地緩解了鹽脅迫對(duì)羽衣甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。

鹽脅迫能抑制植物的呼吸代謝，這個(gè)過程中細(xì)胞內(nèi)ROS大量增加（如H2O2等），對(duì)植物造成次生傷害，如細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化。植物為了清除體內(nèi)ROS，植物體內(nèi)的抗氧化酶活性會(huì)相應(yīng)提高，增加植物耐鹽能力[19-20]。鹽脅迫下，植物SOD、CAT和APX等抗氧化酶協(xié)同作用，清除過多的活性氧，使活性氧代謝處于平衡狀態(tài)，保護(hù)生物膜的完整性，使其在一定范圍內(nèi)忍耐鹽脅迫。但是，當(dāng)活性氧的產(chǎn)生超過了抗氧化系統(tǒng)的消除能力時(shí)，植物就會(huì)受到傷害[21]。SOD催化O-2發(fā)生歧化反應(yīng)，從而避免O-2對(duì)細(xì)胞的毒性傷害，而歧化反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的H2O2則由CAT、APX等來清除[22-23]。也有研究認(rèn)為，H2O2是活性氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要內(nèi)源信號(hào)分子，在植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性中起著重要作用[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽脅迫下，3種抗氧化酶活性都比空白對(duì)照增強(qiáng)。但在高鹽脅迫下，適當(dāng)濃度的H2O2能夠提高羽衣甘藍(lán)葉片SOD、CAT以及APX的活性，而清除劑處理下，則3種抗氧化酶與僅鹽脅迫處理相比顯著下降。表明低濃度的H2O2鹽脅迫條件下有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

H2O2作為信號(hào)分子也脅迫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)。在一定條件下，H2O2作為一種信號(hào)分子，可以調(diào)節(jié)一系列相關(guān)基因的表達(dá)[25-26]。例如，當(dāng)植物被病原體感染時(shí)，植物體內(nèi)的H2O2誘導(dǎo)PR-1和PAL 基因的表達(dá)[27]。有人把豆類植物用 10 mmol/L H2O2處理，其免疫反應(yīng)中類NOS活性提高近8.3倍。大豆（Glycine max L.）細(xì)胞用外源H2O2處理，細(xì)胞質(zhì)APX的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高[28]。如果用APX抑制劑羥基脲或CAT抑制劑氨基三唑處理培養(yǎng)的水稻（Oryza sativa L.）細(xì)胞，H2O2的產(chǎn)量明顯增加，它使APX的轉(zhuǎn)錄水平大幅提高[29]。另有研究表明，H2O2激活促原分裂蛋白激酶（MAPK）進(jìn)一步增強(qiáng)抗氧化酶防御酶活性[30]。本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫下，3種抗氧化酶的基因表達(dá)受過氧化氫正調(diào)控（圖3），表明抗氧化防御系統(tǒng)增加了植物對(duì)鹽脅迫的耐受性和內(nèi)源性過氧化氫的積累有關(guān)。

綜上所述，在鹽脅迫條件下，H2O2參與了羽衣甘藍(lán)抗氧化保護(hù)酶活性的調(diào)節(jié)，同進(jìn)也參與了抗氧化酶基因表達(dá)調(diào)控，它可能是鹽脅迫誘導(dǎo)的羽衣甘藍(lán)葉片抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的重要調(diào)控因子。

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