劉國慧 谷安鑫 殷洪濤 曹 陽 賀云龍 王春波 鄂明艷

原蘇木素A對胃癌SGC-7901細胞系放療增敏作用的研究

劉國慧 谷安鑫 殷洪濤 曹 陽 賀云龍 王春波 鄂明艷

目的本研究將原蘇木素A、蘇木醇提物、順鉑分別與放療聯(lián)合作用于胃癌細胞SGC-7901細胞系，研究原蘇木素A是否增加胃癌SGC-7901細胞系放射敏感性，為臨床用藥開創(chuàng)更新的領域。方法體外培養(yǎng)人胃癌細胞SGC-7901細胞系，以蘇木醇提物、順鉑為對照，MTT法檢測原蘇木素A對細胞增殖作用的影響，以及其與作用濃度和作用時間的關系；采用克隆形成實驗，擬合細胞存活曲線，以單純放療組為對比，計算放射增比(SER)，分析原蘇木素A的增敏效果。結果原蘇木素A對人胃癌細胞SGC-7901有生長抑制作用，但抑制作用相對較弱，其細胞毒性有明顯的時間和濃度依賴性。不同作用時間及作用濃度下的細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變。克隆形成實驗顯示原蘇木素A顯著增加了SGC-7901細胞的放射敏感性，與單純放射組對比，差異有統(tǒng)計學意義。結論原蘇木素A對胃癌SGC-7901細胞的抑制有濃度和時間的依賴性，聯(lián)合放射治療能夠提高放射增敏作用，兩者可能具有協(xié)同抗腫瘤作用。

原蘇木素A；蘇木醇提物；胃癌；放射治療；放射敏感性

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高居全球惡性腫瘤的前4位。我國是胃癌高發(fā)區(qū)，2015年我國胃癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第2位[1]。目前，治愈胃癌的主要方法為根治性手術，然而根治術后區(qū)域局部復發(fā)和遠處轉移則成為治療失敗的主要原因。因此，術前的放療、新輔助化療及術后的同步放化療等圍手術期的輔助治療越顯關鍵。最近幾年，胃癌的放射治療在不斷探索中由開始的姑息性治療轉變?yōu)檩o助治療。近年來，逐漸形成以手術治療為基礎，以化療、放療、靶向治療、熱灌注治療等一系列治療為輔的綜合治療模式[2]。

蘇木(Caesal Piia SappanL，cAE)屬于一種來源于豆科云實屬植物的干燥心材。現(xiàn)代藥理學研究表明其具有抗腫瘤、免疫抑制等作用，臨床上也用于腫瘤的治療[3]。研究發(fā)現(xiàn)，cAE提純的重要活性成分可對腫瘤細胞增殖呈現(xiàn)抑制作用、促進腫瘤細胞的凋亡、對腫瘤細胞的侵襲和轉移有抑制作用；與部分化學藥物聯(lián)合，可明顯提高療效，同時具有無明顯血液系統(tǒng)毒性、逆轉腫瘤細胞耐藥和提高機體免疫力等作用[4]。臨床及體外實驗證明，蘇木提純物對包括肺癌、結腸癌、胃癌、肝癌等多系統(tǒng)腫瘤具有不同程度的抗腫瘤作用[5-6]?；谔K木提純物具有多“靶點”抗腫瘤作用，為明確其單體成分原蘇木素A是否為主要抗腫瘤成分，及其對放療是否有增敏效應。本研究通過體外實驗研究證明原蘇木素A對腫瘤細胞的抑制作用及對胃癌放射的增敏作用，為進一步開展原蘇木素A與放療聯(lián)合應用于胃癌的臨床治療奠定理論基礎，并為將來臨床中藥治療腫瘤的提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及處理

人胃癌SGC-7901細胞系由黑龍江省腫瘤防治研究所提供。細胞使用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原蘇木素A由黑龍江大學生化中心提供。蘇木95%醇提物由黑龍江中醫(yī)藥大學藥理學系研制并提供。順鉑為江蘇奧賽生產。

1.2 放射條件

放射源為哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院放療科Elektasynergy直線加速器，能量為4 MeV，劑量率300 cGy/分。照射野充分覆蓋培養(yǎng)瓶，照射時將培養(yǎng)瓶細胞面朝上放置，并墊1 cm厚組織補償膜。

1.3 MTT增殖抑制實驗

將原蘇木素A用DMSO配制成濃度：100 μM，200 μM，400 μM，800 μM，1600 μM；蘇木醇提物用PBS稀釋成濃度：50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL。順鉑稀釋成濃度為：2 μg/mL，3 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL。細胞計數(shù)后將細胞懸液稀釋為1×104/mL，按每孔5 000個細胞接種到96孔板，每孔體積約100 μL，每個劑量點設4個復孔，設對照組(僅加培養(yǎng)液，不加細胞)，分別加入相應濃度的原蘇木素A、蘇木素醇提物及順鉑純品的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，按培養(yǎng)24 h、48 h及72 h的藥物作用時間，相應時間取出96孔板，在避光條件下每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上低速振蕩10 min使結晶物充分融合比色。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度(OD)值，同時設置對照孔，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4 克隆形成實驗

將培養(yǎng)瓶中指數(shù)生長期的SGC-7901細胞消化、離心后，制成單細胞懸液，并按梯度稀釋成不同濃度，根據(jù)各個劑量點需接種的細胞數(shù)將細胞接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，設0、2、4、6、8、10 Gy劑量點，每個劑量點設置4個培養(yǎng)瓶，并分成原蘇木素A組、蘇木醇提物組、順鉑組及對照組。細胞接種后約12 h更換培養(yǎng)液，根據(jù)MTT檢測結果，計算原蘇木素A 400 μM時藥物濃度為196.2 μg/μL，原蘇木素A 800 μM時藥物濃度為392.4 μg/μL，蘇木95%醇提物50 μg/mL時藥物濃度為90 μM，順鉑2 μg/mL時藥物濃度為144 μM。更換培養(yǎng)液后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)10～14天，甲醛固定，結晶紫染色，計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)。計算貼壁率及各劑量點細胞存活率：貼壁率=對照組克隆數(shù)/種植細胞數(shù)×100%；存活率=(實驗組克隆數(shù)/種植細胞數(shù)×貼壁率)×100%；克隆形成率(PE)=克隆數(shù)/接種的細胞數(shù)。根據(jù)上述計算所得結果按多靶單擊方程SF擬合細胞存活曲線，計算增敏比(SER值)，上述實驗進行三次重復。

1.5 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析應用SPSS 19.0軟件，MTT增殖抑制實驗測定三種藥物濃度和時間與SGC-7901細胞存活率的關系曲線，克隆形成實驗選取多個劑量點來評估細胞放射生物學特征，以此利用單擊多靶模型SF=1-(1-e-D/D0)N估計增敏效應，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原蘇木素A和蘇木醇提物對SGC-7901細胞的生長抑制作用

MTT實驗是檢測不同濃度的原蘇木素A、蘇木醇提物、順鉑分別作用24 h、48 h、72 h后對SGC-7901細胞的生長抑制情況，以觀察藥物濃度和作用時間對細胞存活率的影響(圖1)。通過計算原蘇木素A細胞抑制率，可以看出在相同作用時間下，作用24 h時，原蘇木素A組最大濃度1 600 μM的細胞抑制率為最小濃度100 μM的-0.99倍；作用48 h時，最大濃度細胞抑制率為最小濃度的2.12倍；作用72 h時，最大濃度細胞抑制率為最小濃度的3.15倍。在相同濃度下，低濃度原蘇木素A100 μM 72 h的細胞抑制率為24 h的2.61倍；高濃度1 600 μM 72 h的細胞抑制率為24 h的8.23倍；由此分析出原蘇木素A對SGC-7901細胞抑制率呈明顯的時間和濃度依賴性(表1，圖2)。通過計算，得出原蘇木素A 24 h半數(shù)生長抑制濃度為1965 μmol/L，72 h為119 μmol/L，其中不同組別半數(shù)生長抑制濃度IC50對比見表2。進一步分析出三種藥物對SGC-7901細胞的抑制作用為順鉑>蘇木醇提物>原蘇木素A。

圖1 MTT法測定三種藥物濃度和時間與SGC-7901細胞存活率的關系曲線Figure 1 Relationship between survival rates and doses of three drugs in SGC-7901 cells for different time-point treatmentsNote：The logarithmic-effect curve respectively Protosappanin A(A)Caesalpinia Sappan L Extract(B)Cisplatin(C)that acting on 24 h，48 h and 72 h.

表1 MTT法測定三種藥物不同作用劑量及時間的平均抑制率Table 1 The average inhibitory rates of three drugs in SGC-7901 cells for different time-point treatments

表2 MTT法測定三種藥物不同作用時間的半數(shù)抑制濃度Table 2 Median concentration of three drugs in SGC-7901 cells

Note：IC50：Median inhibitory concentration；P<0.05.

圖2 原蘇木素A對細胞抑制率關系曲線圖Figure 2 Inhibitory rates of Protosappanin A in SGC-7901 cells

2.2 原蘇木素A放射增敏作用

根據(jù)克隆形成實驗擬合出SGC-7901的細胞存活曲線(圖3)。結果表明，單純接受400 μM及800 μM原蘇木素A孵育24 h后，細胞的貼壁率與對照組無顯著性差異，但在分別接受了2、4、6、8、10 Gy的劑量照射后，原蘇木素A孵育組細胞的存活分數(shù)隨放射劑量的增加明顯下降。細胞存活曲線的生物學參數(shù)見表3。通過與單純放療組做對比，計算出原蘇木素A高劑量組的增敏比為1.29。實驗結果說明三種藥物對SGC-7901細胞的放射增敏作用為原蘇木素A 800 μM>順鉑>原蘇木素A 400 μM>蘇木醇提物。

圖3 聯(lián)合作用組和對照組SGC-7901細胞的存活曲線Figure 3 Survival curves of SGC-7901 cells treated with PrA with radiotherapyNote：R：Radiotherapy alone；AR(HP+R)：High dose of PrA with radiotherapy；BR(P+R)：Cisplatin with radiotherapy；CR(LP+R)：Low dose of PrA with radiotherapy；DR(E+R)：Caesalpinia Sappan L Extract with radiotherapy.

表3 聯(lián)合作用組和對照組SGC-7901細胞存活曲線的相關參數(shù)Table 3 Parameters of drug combined with radiotherapy in SGC-7901 cells

Note：P=0.04.D0：Mean lethal dose；Dq：Quasithreshold dose；D37：the corresponding radiation dose that the cell survival rate was 37%；SF2：Surviving fraction at 2 Gy；SER：Sensitivity enhancement ratio.

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，全世界每年胃癌發(fā)生在中國的新發(fā)病例高達40%以上[7]，雖然手術及術后的放化療可以改善患者的預后，新一代化療藥物也不斷涌現(xiàn)，放療技術不斷進步，但是放化療的5年生存率仍無顯著提高[8]，因此尋找新的有效治療策略勢在必行。

隨著放射治療技術的發(fā)展，以及化療藥物的不斷更新，放/化綜合治療也在不斷進步，其理論基礎就是基于兩者的空間協(xié)同作用，即放射治療針對局部和區(qū)域病變，而化療作為全身治療能夠殺滅或控制轉移病變[9-10]。但是，放、化同時進行，也會增加全身毒性或局部毒性反應，當今抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點可追隨于應用中草藥研究療效高、低毒性的抗腫瘤藥物[11]。蘇木素在多種實驗中被證實有抗腫瘤作用，但是是何種成分起到主要的抗腫瘤作用尚未清楚[12-14]。因此為研究其成分原蘇木素A對腫瘤細胞的生長抑制作用及是否有放射增敏效果，本研究以人胃癌SGC-7901細胞系為主要研究對象，進行了相關研究。通過MTT實驗，發(fā)現(xiàn)原蘇木素A對SGC-7901細胞的生長抑制作用較弱，最大藥物濃度的抑制率不超過30%，這至少說明原蘇木素A對體外培養(yǎng)細胞的抗腫瘤作用較弱。但隨著作用時間的增加，抑制率逐漸增加。MTT染色后，孔板底部可見少量的藍紫色結晶物質，且隨著時間的推移及劑量的增加，藍紫色逐漸變淺，這也說明藥物作用后該細胞系呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，上述觀察結果均表明原蘇木素A作用于SGC-7901細胞上的抑制作用有時間依賴性和濃度依賴性。本研究結果也說明，單獨使用原蘇木素A的抗腫瘤作用較弱，不適合作為獨立的治療藥物，而應用于放化療聯(lián)合，會增加放化療的殺傷作用。

通過放射生物學測定腫瘤干細胞增殖能力的有效方法常為克隆形成實驗，這種由單個細胞不斷復制形成的細胞群體稱為克隆或集落[15]。通過克隆形成實驗我們選取多個劑量點來評估細胞放射生物學特征，以此利用單擊多靶模型SF=1-(1-e-D/D0)N估計增敏效應[16]。本實驗數(shù)據(jù)結果顯示接受400 μM及800 μM原蘇木素A孵育24 h后，細胞的貼壁率與對照組無顯著性差異，但在接受了2～10 Gy的劑量照射后，原蘇木素A孵育組細胞的細胞存活分數(shù)明顯下降。放射抗拒的SGC-7901細胞在大劑量原蘇木素A作用后，其放射敏感性增加，800 μM放射增敏比為1.29。評判某種增敏方法效能的大小，通常是通過增敏比(SER)來衡量的，如有增敏效果，則指標結果SER>1.0(P<0.05)，增敏效果越明顯，其數(shù)值越大[17]。通過實驗結果說明三種藥物對SGC-7901細胞的放射增敏作用為原蘇木素A 800 M>順鉑>原蘇木素A 400 μM>蘇木醇提物。因此說明原蘇木素A對SGC-7901細胞系的克隆源性細胞的抑制作用較弱，但通過放射敏感性的增加使腫瘤細胞存活減少。

綜上所述，本研究通過胃癌SGC-7901細胞的體外研究，證實了原蘇木素A對胃癌細胞放射增敏的作用，其具體機制有待于進一步研究。因順鉑為常用化療藥物，但其毒副作用較大，而原蘇木素A為蘇木素提取成分，其生物活性廣，低毒，因此是否可以替代細胞毒類化學藥物，廣泛應用于臨床作為放射增敏劑尚需通過臨床試驗研究。

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ProtosappaninAincreasesthesensitivityofgastriccancerSGC-7901cellstoradiotherapy

LIUGuohui，GUAnxin，YINHongtao，CAOYang，HEYunlong，WANGChunbo，EMingyan

Department of Radiation Oncology，Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveIn this study，Protosappanin A，Caesalpinia Sappan L extract and Cisplatin were combined with radiotherapy in gastric cancer cell SGC-7901 to investigate whether the Protosappanin A could increase radiosensitivity(SER)in gastric cancer SGC-7901 cells.This will be medication to create new areas of innovation in the future.MethodsThe cell proliferation of SGC-7901 cells was detected by MTT assay.The relationship between the effect of the Protosappanin A on cell proliferation and the time of action was determined.Caesalpinia Sappan L extract and Cisplatin were as controls.The fitted cell survival curve and clonal formation assays were used to determine the SER to analyze the sensitizative effect of Protosappanin A.ResultsProtosappanin A could inhibit the growth of SGC-7901 cells，and its inhibitory effect is relatively weak.Its cytotoxicity has a time-and concentration-dependent manner.Cellular morphological changes were observed accompanying with increased concentrations and time treatments of Protosappanin A.Clonal formation experiment showed that the Protosappanin A significantly increased the radiosensitivity of SGC-7901 cells when compared to the radioactive group.They showed a statistically difference.ConclusionThe inhibitory effect of the Protosappanin A on SGC-7901 cells in a concentration and time-dependent manner.Protosappanin A combined radiotherapy can improve the radiosensitization of cells，both of which may have synergistic anti-tumor effect.

Protosappanin A；Caesalpinia Sappan L extract；Gastric cancer；Radiotherapy；Radiosensitivity

哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸部放療二病區(qū)(哈爾濱 150081)

劉國慧，女，(1989-)，碩士，住院醫(yī)師，從事胸腹部腫瘤放射治療的研究。

鄂明艷，E-mail：emingyansci@126.com

R285.6；R730.5

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.004

(收稿：2017-05-21)