劉祥含 唐天向 孫 超 隋麗波 張 慧 張傳利 李麗萍 林良斌

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院1，昆明 650201) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院2, 普洱 665000) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心3，昆明 650201)

幾個(gè)關(guān)鍵油脂合成酶活性對(duì)油菜含油量影響的研究

劉祥含1唐天向1孫 超1隋麗波1張 慧1張傳利2李麗萍3林良斌1

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院1，昆明 650201) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院2, 普洱 665000) (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心3，昆明 650201)

以不同含油量的甘藍(lán)型油菜品種或品系為材料，采用ELISA 法檢測(cè)了油脂累積過程中乙酰輔酶A羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷脂酸磷酸酯酶、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶等4種關(guān)鍵酶在不同發(fā)育時(shí)期的種子和角果皮中的酶活性變化，并分析了酶活性與種子含油量的相關(guān)性。研究結(jié)果表明，不同含油量的油菜品種在種子和角果皮中酶活性的變化趨勢(shì)基本一致，在開花后第17天至第24天迅速增加，第38天時(shí)達(dá)到峰值，然后逐漸下降，但角果成熟時(shí)間較短的酶活性下降很快，如花油8號(hào)的角果成熟期只有40.2 d，比其他3個(gè)品種早熟1周。相關(guān)性分析表明種子中DGAT、PPase、G6PDH的酶活性與菜籽含油量呈極顯著正相關(guān)，ACCase酶活性與菜籽含油量呈顯著正相關(guān)，而角果皮中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT的酶活性與菜籽含油量呈正相關(guān)，但沒達(dá)到顯著水平，其中4種酶的酶活性與菜籽含油量的相關(guān)性大小依次為DGAT、PPase、G6PDH、ACCase。因此，在進(jìn)行高含油量油菜品種選育時(shí)應(yīng)著重考慮油脂累積中DGAT、PPase的基因表達(dá)水平和酶活性水平。

油菜 含油量 ACCase G6PDH PPase DGAT

油菜(Brassicanapus)是我國(guó)乃至世界上的主要油料作物之一，是植物油脂的第三大來(lái)源，我國(guó)的油菜種植面積和總產(chǎn)量均位居世界第一[1]，菜籽的含油量直接影響著油菜的經(jīng)濟(jì)效益，是當(dāng)前油菜育種中重要的技術(shù)難點(diǎn)，因此提高菜籽含油量是當(dāng)前油菜育種的主要目標(biāo)之一[2]。油菜種子油脂累積涉及十多個(gè)酶促反應(yīng)，酶活性的高低直接影響著菜籽的含油量。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)酶活性與含油量的關(guān)系開展了一些研究工作，例如，Turnham 等[3]研究表明油菜種子中脂肪酸合成速率受控于ACCase活性的高低，認(rèn)為ACCase是油菜種子中油脂累積的一個(gè)關(guān)鍵限速酶；Ohlrogge等[4-5]和Topfer等[6]的研究認(rèn)為對(duì)油菜種子油脂累積關(guān)鍵受ACCase、PPase和DGAT等酶活性高低的影響；陳玉萍等[7]研究結(jié)果表明高含油量油菜品系的G6PDH活性高于低含油量品系，且油分合成旺盛的時(shí)期G6PDH活性最大；唐湘如等[8]研究表明，油菜種子的PPase酶活性與種子含油量有密切關(guān)系，在育種中可作為選擇高含油量品種的生化指標(biāo)之一。然而前人研究一般以2個(gè)不同含油量的油菜品種為材料，只對(duì)油脂累積過程中1～3個(gè)酶進(jìn)行研究，并且沒有進(jìn)行不同發(fā)育時(shí)期的酶活性變化規(guī)律研究和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。

本研究以不同含油量4個(gè)油菜品種或系為材料，研究了油菜種子發(fā)育過程中乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoAcarboxylase ，ACCase)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH)、磷脂酸磷酸酯酶(Phospha-tidic acid phophyhydrolase，PPase)、二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(Diacylglycero-lacyl transferase，DGAT)4種酶在油菜種子發(fā)育過程中種子和角果皮中的酶活性變化趨勢(shì)及酶活性高低與含油量的關(guān)系，并進(jìn)行了種子酶活性高低與菜籽含油量的相關(guān)性分析，同時(shí)研究了4個(gè)油菜品種的生育習(xí)性，希望弄清相關(guān)酶活性及生育習(xí)性對(duì)菜籽含油量的影響及其程度大小，從而揭示油菜高含油量的生理生化機(jī)制，希望在酶促反應(yīng)相關(guān)酶活性及變化趨勢(shì)上為育成高含油量油菜提供了酶活力數(shù)據(jù)的支持，從而為油菜高含油量育種和栽培提供酶活性及生育習(xí)性方面的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為4個(gè)不同含油量的甘藍(lán)型油菜品種或品系，即是：ZY511，其種子含油量為 50.21%；LCD07-4，其種子含油量為47.19%；花油8號(hào)，其種子含油量為42.57%；湘油774，其種子含油量為37.32%，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室提供。

ELISA試劑盒：上海優(yōu)選生物科技有限公司，型號(hào)分別為CK-E0066P、CK-E0089P、CK-E0173P和CK-E0256P。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜種植與取樣

4個(gè)油菜材料于2015年10月10日種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場(chǎng)，并進(jìn)行常規(guī)油菜栽培管理。在油菜開花時(shí)對(duì)植株長(zhǎng)勢(shì)一致的主花序基部1/3處當(dāng)天開放的花蕾進(jìn)行掛牌，并標(biāo)記日期。在開花后第17天進(jìn)行取樣，每隔7 d取樣1次，共5次，每個(gè)品種取樣3株。將取下的樣品立即放入冰盒中，在冰浴中迅速將種子和角果分離，分別稱重0.2 g鮮組織用液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每種組織材料保存4份，用于粗酶液的提取。

1.2.2 油菜生育習(xí)性調(diào)查

每個(gè)材料隨機(jī)取5株分別記錄每株花期(以第1朵花開到最后1朵花落)、角果成熟期(以主花序中部角果從花落到角果成熟)、生育期(從播種到成熟收獲)。

1.2.3 粗酶液的分離制備

從-80 ℃冰箱中取出材料放入研缽中加液氮研磨成粉末，并迅速盡量全部轉(zhuǎn)移入10 mL離心管內(nèi)，加入2 mL預(yù)冷的提取Buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH=7.3、300 mmol/L 甘油、5 mmol/L DTT、2 mol/L EDTA、0.5 mmol/L PMSF、0.01%體積Triton X-100)，然后在渦旋振動(dòng)器上振動(dòng)2 min充分混勻后4 ℃靜置1 h，再加10 μL 0.5 mmol/L PMSF并混勻，4 ℃靜置1 h。4 ℃、3 500 r/min離心30 min，將上清液盡量轉(zhuǎn)移到另一離心管內(nèi)，并定容至體積2 mL，即為粗酶液，用于酶活性測(cè)定。

1.2.4 ELISA法測(cè)定酶活性

在酶標(biāo)板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、樣本酶活性檢測(cè)和酶標(biāo)儀零校對(duì)。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同酶活力單位的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔加待測(cè)樣本10 μL(以a表示)，再加樣本稀釋液40 μL；空白孔加去離子10 μL，再加樣本稀釋液40 μL。吸附結(jié)合30 min鐘后用洗滌液洗板5次。然后每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴保溫60 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加洗滌液300 μL，靜置1 min，棄去洗滌液，在吸水紙上拍干，如此洗板 5 次。每孔再加入底物 A、底物B各50 μL，37 ℃ 水浴避光保溫15 min。然后每孔再加入終止液50 μL，15 min 內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。然后以標(biāo)準(zhǔn)孔的OD450值和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力單位制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后以樣品孔的OD450值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得粗酶液樣品的酶活力單位(以b表示)。每克鮮組織的酶活力按公式計(jì)算(1 U是指在標(biāo)準(zhǔn)條件下1 min能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的所需酶量)，各樣品的酶活性測(cè)定重復(fù)3次。

U/g=b/a×2 000÷0.2

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2010作圖；采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含油量油菜品種的生育習(xí)性

隨機(jī)選取5株，對(duì)各油菜品種的生育習(xí)性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明(表1)，試驗(yàn)材料的生育期不同，花油8號(hào)為早熟品種，生育期只有176.6 d，而其他3個(gè)材料生育期相差不大，較花油8號(hào)晚熟10 d以上。生育期長(zhǎng)的材料，其角果成熟期和花期也相對(duì)較長(zhǎng)，但角果成熟期變化較大，花油8號(hào)比其他3個(gè)材料短1周以上，而花期變化較小，花油8號(hào)比其他3個(gè)材料短2 d。

表1 不同油菜品種的生育習(xí)性

2.2 種子和角果皮中ACCase的活性變化及其對(duì)菜籽含油量的影響

對(duì)不同含油量的油菜品種/品系進(jìn)行了種子和角果皮的ACCase活性檢測(cè)，結(jié)果(圖1)表明，所有研究對(duì)象的種子ACCase活性均高于角果皮的，特別是在中期角果中高2U左右。在開花后17～38 d各試驗(yàn)材料種子和角果皮的ACCase活性呈上升變化，其中從開花后17～24 d ACCase活性上升很快，但種子的比角果皮的上升要緩慢些，而在24 d后種子的比角果皮的上升要快些。第38天后除花油8號(hào)的迅速下降，湘油774的稍有上升，其他2個(gè)材料的不再呈上升趨勢(shì)，這可能與花油8號(hào)的角果成熟期短有關(guān)，因?yàn)?8 d時(shí)它的角果開始變黃成熟，而其他品種在45 d后才開始變黃成熟。在不同發(fā)育時(shí)期的種子中含油量高的材料的ACCase活性均高于含油量低的，只是幅度不一樣，但角果皮的ACCase活性就不呈現(xiàn)這樣一個(gè)關(guān)系，如在中期角果中LCD07-4角果皮的ACCase活性接近甚至略高于ZY511的。這可能是由于角果皮主要是在進(jìn)行光合作用和物質(zhì)積累，為油脂合成和累積提供物質(zhì)和能量，因此，角果皮中油脂合成酶的活性可能與菜籽含油量高低關(guān)系不大。

圖1 種子和角果皮中ACCase活性動(dòng)態(tài)變化

2.3 種子和角果皮中G6PDH活性變化及其對(duì)菜籽含油量的影響

對(duì)不同含油量的油菜品種/品系進(jìn)行了種子和角果皮的G6PDH活性檢測(cè)，結(jié)果(圖2)表明，所有材料的種子G6PDH活性均高于角果皮的，不同時(shí)期的種子和角果皮的酶活性變化趨勢(shì)如同ACCase，但從開花后17～24 d 酶活性上升非常緩慢，從24～31 d酶活性迅速上升，31～38 d G6PDH活性上升速度變緩，從38～45 d花油8號(hào)迅速下降，而其他3個(gè)材料的種子中酶活性或保持不變或略有下降，其原因如上所述。在第31天后含油量高的材料的種子和角果皮中的G6PDH活性均高于含油量低的，但31 d前并不呈現(xiàn)這樣的關(guān)系，花油8號(hào)的酶活性還高于LCD07-4，說明這個(gè)酶在31 d后對(duì)油脂累積影響比較大。

圖2 種子和角果皮中G6PDH活性動(dòng)態(tài)變化

2.4 種子和角果皮中PPase活性變化及其對(duì)菜籽含油量的影響

對(duì)不同含油量的油菜品種/品系進(jìn)行了種子和角果皮的PPase活性檢測(cè)，結(jié)果(圖3)表明，所有試驗(yàn)材料的種子PPase活性均高于角果皮的，不同時(shí)期的種子和角果皮的酶活性變化趨勢(shì)如同前2種酶的活性變化。除LCD07-4外，其他3個(gè)材料在第38天前種子中的PPase活性均呈持續(xù)上升，而LCD07-4在24～31 d PPase活性上升非常緩慢，以致早期角果酶活性高的LCD07-4在中期角果中與花油8號(hào)的酶活性處于相同的水平，但第38天后花油8號(hào)的PPase活性迅速下降，這可能是花油8號(hào)的含油量低于LCD07-4的原因。在角果皮中第31天前的PPase活性均呈較迅速上升，第31天后除了湘油774的酶活性呈持續(xù)上升外，花油8號(hào)開始下降，并在38 d后迅速下降，其他2個(gè)材料酶活性上升緩慢或略有下降。在不同發(fā)育時(shí)期的種子和角果皮中含油量高的材料PPase活性一般都高于含油量低的，但LCD07-4與花油8號(hào)不呈現(xiàn)這種關(guān)系，可能與花油8號(hào)油脂累積時(shí)間短、第38天后其PPase活性迅速下降有關(guān)。

圖3 種子和角果皮中PPase活性動(dòng)態(tài)變化

2.5 種子和角果皮中DGAT活性變化及其對(duì)菜籽含油量的影響

對(duì)不同含油量的油菜品種/品系進(jìn)行了種子和角果皮的DGAT活性檢測(cè)，結(jié)果(圖4)表明，所有研究對(duì)象的種子DGAT活性均高于角果皮的，在38 d前種子中DGAT活性除湘油774呈緩慢上升外，其他3個(gè)材料呈迅速上升，38 d后除花油8號(hào)的迅速下降外，其他3個(gè)材料的呈非常緩慢上升或保持不變。在角果皮中DGAT活性各試驗(yàn)材料38 d前均呈緩慢上升，38 d后除花油8號(hào)的迅速下降外，其他3個(gè)材料保持不變或稍有下降。在不同發(fā)育時(shí)期的種子中含油量高的材料DGAT活性均高于含油量低的，但角果皮就不呈現(xiàn)這種關(guān)系，如含油量低的花油8號(hào)還高于含油量高的LCD07-4，這說明種子中DGAT活性對(duì)菜籽含油量的影響更大。

圖4 種子和角果皮中DGAT活性動(dòng)態(tài)變化

2.6 油脂累積的關(guān)鍵酶分析

分別對(duì)種子和角果皮中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT酶活性與菜籽含油量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果(表2)表明，在種子中4種酶的活性與菜籽含油量呈顯著正相關(guān)，而角果皮中4種酶的活性與菜籽含油量呈正相關(guān)，但沒達(dá)到顯著水平，說明種子中酶活性對(duì)菜籽含油量的影響顯著大于角果皮的，而且種子中、DGAT的酶活性與菜籽含油量呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)性大小依次為DGAT>PPase>G6PDH>PPase，說明油脂累積過程中后階段酶的活性對(duì)菜籽含油量影響更大。因此，DGAT 、PPase是油脂累積極為關(guān)鍵的酶，其酶活性高低可作為高含量育種的選擇指標(biāo)。

表2 種子和角果皮中酶活性與菜籽含油量的相關(guān)性

注：**表示 0.01 水平上顯著，*表示 0.05 水平上顯著。

3 討論與結(jié)論

含油量是當(dāng)前油菜育種的一個(gè)主要育種目標(biāo)，許多研究者已從遺傳、生理生化和分子生物學(xué)方面研究了油菜含油量的生物學(xué)問題。本研究通過ELISA 法檢測(cè)了油菜種子發(fā)育過程中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT酶活性變化，發(fā)現(xiàn)不管是含油量高的油菜，還是含油量低的油菜，在種子和角果皮中4種關(guān)鍵油脂合成酶的酶活性變化基本一致，在中期角果中達(dá)到最高值，即38DAF左右的角果。這與唐湘如等[8]、徐一蘭[9]和戚維聰[10]的研究結(jié)果一致，但代柳婷[11]的研究結(jié)果表明高含油量品種在40DAF低含油量品種在45DAF時(shí)PPase酶活性達(dá)到最高。本研究還發(fā)現(xiàn)油脂合成酶的酶活性高低對(duì)油菜含油量的影響非常大，酶活性高的品種或品系其含油量也高，酶活性低的品種或品系其含油量也低，特別是后期酶活性酶活性和角果成熟期的長(zhǎng)短對(duì)油菜含油量的影響更大。這與前期研究者的研究結(jié)果基本一致。此外，在油脂累積過程中不同酶的酶活性對(duì)油菜含油量的影響是不一樣的，越是后期的酶影響就越大，種子中DGAT、PPase、G6PDH的酶活性與油菜含油量的相關(guān)性最大，達(dá)到極顯著水平，是油脂合成最為關(guān)鍵的酶，但角果皮中酶活性對(duì)油菜含油量有影響，沒有達(dá)到顯著水平。

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Influence on Seed Oil Content by Activities of Several Key Enzymes in Oil Synthesis of the Brassica napus

Liu Xianghan1Tang Tianxiang1Sun Chao1Sui Libo1Zhang Hui1Zhang Chuanli2Li Liping3Lin Liangbin1
(College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agriculture University1, Kunming 650201) (College of Tropical Crops, Yunnan Agriculture University2, Puer 665000) (Experimental Teaching Center for Agricultural Profession Course, Yunnan Agriculture University3, Kunming 650201)

Withbrassicanapusvarieties or strains with different oil contents as experimental materials, the activity of four key enzymes in the process of oil accumulation, namely, acetyl-coa carboxylase (accase), glucose-6-Phosphate dehydrogenase (G6PDH), phospha-tidic acid phophyhydrolase (ppase), and diacylglycero-lacyl transferase(DGAT), were detected by ELISA methods in seed and pod peel at different developmental stages, and the correlation between enzyme activity and seed oil content was analyzed. The results indicated that the variation trend of enzyme activities in seeds and pod peel of rapeseed cultivars with different oil contents was basically the same. The enzyme activity was increased rapidly from the 17th day after flowering (DAF) to the 24th DAF, and reached the peak at the 38th DAF, then it was decreased gradually. However, the enzyme activity was decreased rapidly in Huayou 8 with shorter pod ripening time of 40.2 days, earlier than the other three varieties by a week. The correlation analysis showed that the activities of DGAT, ppase and G6PDH in seeds were extremely significant positively correlated with the seed oil content, the activities of accase were positively correlated with the seed oil content, While the activity of accase, G6PDH, ppase and DGAT in pod peel was positively correlated with the oil content of rapeseed, which did not reach the significant level. The correlation levels of the four kinds of enzymes with oil content in order were as follows: DGAT, ppase, G6PDH and accase. Therefore, the gene expression level and enzyme activity level of DGAT and Ppase genes in oil accumulation should be considered during the breeding of high oil content rapeseed varieties.

brassicanapus, oil content, accase, G6PDH, ppase, DGAT

S565.4

A

1003-0174(2017)12-0100-05

973計(jì)劃(2015CB150206)

2016-12-19

劉祥含，男，1991年出生，碩士，油菜生理生化

林良斌，男，1963年出生，教授，油菜分子生物學(xué)與育種