趙素平， 胡博然， 胡花麗， 周宏勝， 劉紅艷， 李鵬霞

(1.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝產(chǎn)品采后處理工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014)

高質(zhì)量的RNA樣品是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，在總RNA提取時(shí)，能否有效地去除果實(shí)中的多糖、多酚等物質(zhì)，并抑制RNA酶活性，是核酸提取效率及核酸質(zhì)量的重要影響因素[1]。獼猴桃果實(shí)含有較多的多糖、酚類物質(zhì)，由于多糖、酚類物質(zhì)的干擾，使得獼猴桃RNA提取較其他植物RNA提取的難度大[2]。目前國內(nèi)外有關(guān)提取獼猴桃果實(shí)總RNA的方法主要有改進(jìn)的Lopez-Gomez與Gomez-lim方法[3]、異硫氫酸胍法[4]、HAc-NaAc法[5]、RNA提取試劑盒法等，但是異硫氫酸胍法、試劑盒法比較昂貴，HAc-NaAc法提取需要分離DNA、RNA。本研究在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，擬建立1種適于提取獼猴桃果實(shí)總RNA的經(jīng)濟(jì)簡便的方法。另外，內(nèi)參基因的表達(dá)量可以對目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化，以減小樣本之間的差異，內(nèi)參基因在實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)中起重要作用[6]。相同獼猴桃果實(shí)的不同品種、不同部位和不同發(fā)育階段等均會(huì)對同一基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，因此，根據(jù)果實(shí)品種及試驗(yàn)處理，優(yōu)化和選擇用于qRT-PCR的內(nèi)參基因至關(guān)重要。本研究以植物常用的內(nèi)參基因(ACTB、TUB、18SrRNA、GAPDH和Actin)為基礎(chǔ)[7]，擬選擇最適合徐香獼猴桃果實(shí)基因表達(dá)水平研究的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

徐香獼猴桃，購自南京眾彩物流批發(fā)市場，挑選大小相近、無病蟲害、無機(jī)械損傷、成熟度基本一致的果實(shí)進(jìn)行處理。在處理后的3、6、9 d進(jìn)行樣品采集，將果肉組織用液氮冷凍，并在 -70 ℃ 下儲(chǔ)存。

1.2 方法

1.2.1 提取液配制 CTAB抽提液成分：2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CTAB，2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，100 mmol/L Tris-HCl[pH值8.0，用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水配制]，25 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，2.0 mol/L NaCl，0.5 g/L 亞精胺，充分混勻后于121 ℃滅菌30 min。使用前加入100 g/L的β-巰基乙醇、三氯甲烷+異戊醇(體積比 24 ∶1)、8 mol/L LiCl、70%乙醇。以上試劑均用0.1%DEPC處理的滅菌雙蒸水配制。

1.2.2 提取方法

1.2.2.1 試劑盒法提取獼猴桃總RNA 嚴(yán)格按照試劑盒的要求提取總RNA。

1.2.2.2 優(yōu)化CTAB法提取獼猴桃總RNA 在傳統(tǒng)CTAB方法[8]的基礎(chǔ)上，進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。提取步驟：(1)在經(jīng)過DEPC水處理的無RNA的2 mL離心管中加入1 mL CTAB抽提液，再加入100 μLβ-巰基乙醇，混勻備用。(2)取獼猴桃凍樣置于預(yù)冷的研缽中(研缽用乙醇燃燒滅菌后加液氮預(yù)冷)，加入液氮，迅速研磨成均勻的粉末，研磨得越細(xì)越好；稱取0.4 g磨碎的樣品放入有CTAB抽提液的離心管中，立即混勻，65 ℃水浴30 min(每隔5 min混勻1次)。(3)取出離心管，冷卻至室溫，10 000 r/min、10 ℃離心10 min，取上清放入新的無RNA的離心管中。(4)加入等體積三氯甲烷、異戊醇(體積比為24 ∶1)，于室溫條件下劇烈搖動(dòng)5 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液加入無RNA的新離心管內(nèi)，重復(fù)此步驟3次至蛋白層不再出現(xiàn)。(5)吸取上清液至無RNA的新離心管中，加入1/2體積8 mol/L LiCl(使其終濃度為4 mol/L LiCl)，于-20 ℃放置過夜(即沉淀時(shí)間大于8 h)。(6)將于-20 ℃放置8 h以上的離心管取出，13 000 r/min、4 ℃離心30 min。(7)去除上清，用600 μL 75%乙醇洗滌沉淀，于 13 000 r/min、4 ℃離心5 min，重復(fù)此步驟3次，最后一次倒掉乙醇后再空管離心1次，吸出殘留的乙醇，之后在超凈工作臺(tái)上放置5 min，使殘留乙醇揮發(fā)，以免影響下游試驗(yàn)。(8)加20 μL DEPC處理的滅菌雙蒸水溶解沉淀，充分混勻，長期保存于-70 ℃。

1.3 總RNA的質(zhì)量檢測

(1)取2 μL總RNA，用核酸定量分析儀測定并計(jì)算D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值及核酸的濃度，分析其質(zhì)量與濃度。(2)檢測RNA的瓊脂糖凝膠電泳在1×TAE緩沖液中進(jìn)行，在3 μL RNA加樣緩沖液(6×loading buffer)中加入 2 μL 總RNA，混合均勻后點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA的完整性。

1.4 cDNA合成

cDNA的合成嚴(yán)格按照First Strand cDNA Synthesis Kit(由Thermo Scientific Revert Aid提供)操作?？俁NA的純化：反應(yīng)體系含有2 μg/μL RNA，1 μL 10×反應(yīng)緩沖液(含MgCl2)，1 μL(1 U)DNase Ⅰ(RNase-free)，加入無核酸酶的雙蒸水使總體積至10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃溫育30 min后立即冰浴，之后加入1 μL 50 mmol/L EDTA再于65 ℃溫育 10 min，冰浴5 min后即可進(jìn)行cDNA合成。

cDNA合成：在上述體系中加入random primer 1 μL，反應(yīng)總體積調(diào)至12 μL。65 ℃加熱5 min后立即置于冰上降溫，之后加入4 μL 5×反應(yīng)緩沖液，1 μL RiboLock RNase Inhibitor(20 U/μL)，2 μL 10 mmol/L dNTP Mix，1 μL RevertAid M-MuLV RT(200 U/μL)，總反應(yīng)體系為20 μL。之后于25 ℃孵育5 min，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min。將合成產(chǎn)物于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 獼猴桃內(nèi)參基因的篩選

內(nèi)參基因參照張慧琴等的研究[9-10]，詳見表1。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，對5個(gè)基因序列進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10 μL 2×PCR-Mix，各0.8 μL上、下游引物，0.5 μL cDNA，7.9 μL滅菌雙蒸水，總反應(yīng)體系 20 μL。反應(yīng)步驟：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，此步驟35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。通過半定量PCR和qRT-PCR檢測內(nèi)參基因ACTB、TUB、Actin、GAPDH、18S rRNA，挑選適合徐香獼猴桃成熟果實(shí)檢測的內(nèi)參基因。

表1 內(nèi)參基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃總RNA提取結(jié)果

2.1.1 用試劑盒提取獼猴桃貯藏0 d樣品RNA結(jié)果 在波長280、230、260 nm下的吸光度依次代表核酸、鹽、蛋白等有機(jī)物的含量。高純度RNA的D260 nm/D280 nm值應(yīng)介于1.8～2.0之間，D260 nm/D230 nm值大于2.0[11]。從表2可以看出，使用試劑盒提取獼猴桃RNA的D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值整體上分別低于1.8、2.0，這說明RNA中蛋白、多糖等雜質(zhì)污染嚴(yán)重。第3次提取獼猴桃總RNA質(zhì)量有所提高，但是RNA含量低，不利于進(jìn)行下游試驗(yàn)。從圖1可以看出，試劑盒提取獼猴桃總RNA條帶不清晰且彌散，說明RNA有所降解。由圖2可以看出，獼猴桃總RNA條帶清晰但亮度不高，說明RNA含量及純度均較低。因此可知，試劑盒不適合用來提取徐香獼猴桃總RNA。

表2 試劑盒提取獼猴桃RNA的相應(yīng)結(jié)果

2.1.2 CTAB法提取獼猴桃總RNA結(jié)果

2.1.2.1 傳統(tǒng)CTAB法第1次提取獼猴桃總RNA結(jié)果 以貯藏0 d獼猴桃樣品為基礎(chǔ)設(shè)置不同起始質(zhì)量，進(jìn)行總RNA的提取。從表3可看出，隨著獼猴桃樣質(zhì)量的增加，提取的獼猴桃總RNA含量會(huì)相應(yīng)提高，但D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值也隨之下降，說明提取的總RNA含有多糖、多酚等物質(zhì)，總RNA質(zhì)量不高，不適合用于下游分子生物學(xué)試驗(yàn)。

表3 CTAB法提取獼猴桃貯藏0 d樣品RNA的結(jié)果

2.1.2.2 第1次優(yōu)化條件提取獼猴桃總RNA結(jié)果 優(yōu)化條件：獼猴桃樣質(zhì)量選擇0.5 g，CTAB含量由2.0%提高至2.5%，β-巰基乙醇含量由2%提高到10%，三氯甲烷-異戊醇抽提次數(shù)增加至3次。利用優(yōu)化后的CTAB法提取獼猴桃果實(shí)總RNA，用核酸定量分析儀進(jìn)行檢測。由表4可知，獼猴桃總RNA的D260 nm/D280 nm值基本在1.8～1.9，而D260 nm/D230 nm值介于1.8～2.0，說明總RNA純度提高了，但是仍存在少量多糖、多酚和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。由圖3的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果看出，總RNA電泳結(jié)果呈現(xiàn)2條帶，且28S的亮度比18S的亮度大，但是18S條帶出現(xiàn)了降解，需要進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。

表4 第1次優(yōu)化CTAB法提取獼猴桃總RNA結(jié)果

2.1.2.3 第2次優(yōu)化條件提取獼猴桃總RNA結(jié)果 優(yōu)化條件：樣品質(zhì)量由0.5 g減少至0.3 g，70%乙醇洗滌次數(shù)增加至3次。從表5可以看出，減少獼猴桃提取時(shí)的樣品質(zhì)量，增加乙醇洗滌次數(shù)，可以提高總RNA的純度及質(zhì)量，但D260 nm/D230 nm值仍小于2.0。由圖4可知，獼猴桃總RNA條帶整齊、清晰，但RNA條帶亮度不高，說明RNA樣品含量較低，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化方法，從而提高獼猴桃總RNA的濃度及純度。

表5 優(yōu)化CTAB法提取獼猴桃總RNA結(jié)果

2.1.2.4 第3次優(yōu)化條件提取獼猴桃總RNA結(jié)果 優(yōu)化條件：樣品質(zhì)量0.4 g，LiCl由1/3體積增加至1/2體積，同時(shí)LiCl沉淀時(shí)間為過夜。通過提高樣品質(zhì)量至0.4 g，以及LiCl

沉淀過夜提取總RNA，由表6可知，D260 nm/D280 nm值介于 1.8～2.0之間，D260 nm/D230 nm值基本為2.0左右，表明提取的獼猴桃總RNA質(zhì)量較高。從圖5可以看出，RNA條帶整齊、清晰完整，28S條帶亮度約是18S條帶亮度的2倍，表明總RNA的純度、完整性和產(chǎn)率均較高，蛋白質(zhì)、多糖及多酚等去除得較徹底，可作為反轉(zhuǎn)錄的模板。

表6 優(yōu)化CTAB法提取獼猴桃總RNA結(jié)果

2.2 獼猴桃果實(shí)內(nèi)參基因的篩選

2.2.1 半定量PCR篩選獼猴桃果實(shí)內(nèi)參基因 PCR產(chǎn)物用溴化乙錠染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用GelDoc XR(Bio-Rad，美國)照相記錄。對ACTB、TUB、Actin、GAPDH、18S rRNA 5個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行初步篩選。從圖6看出，將獼猴桃貯藏0 d的cDNA分別加入5對內(nèi)參引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果為ACTB和18S rRNA亮度最高，Actin有二聚體，GAPDH沒有表達(dá)，TUB亮度相對較低，因此內(nèi)參初步篩選結(jié)果為ACTB、18S rRNA。

由圖7可知，將獼猴桃不同時(shí)間和不同處理的cDNA通過分別加入ACTB、18S rRNA、TUB和GAPDH這4對內(nèi)參引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果為ACTB、18S rRNA亮度最高且表達(dá)較穩(wěn)定，TUB亮度相對較低，而GAPDH亮度高但表達(dá)穩(wěn)定性不高。

從圖8可以看出，將貯藏0、3 d的CK組、貯藏3 d的處理組、貯藏6 d的CK組、貯藏6 d的處理組、貯藏9 d的CK組、貯藏9 d的處理組的cDNA通過分別加入Actin內(nèi)參引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示Actin引物均有二聚體，不適合作為徐香獼猴桃的內(nèi)參基因。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ACTB、TUB和18S rRNA 由表7可知，TUB的CT值基本在32以上，說明TUB基因基本不表達(dá)，18S rRNA的CT值介于8.0～11.0之間，值相對偏低，不適宜作為徐香獼猴桃果肉的內(nèi)參基因，而ACTB的CT值介于19.0～24.0之間，表達(dá)穩(wěn)定性相對較高，因此選擇ACTB作為熒光定量PCR的內(nèi)參基因。

3 討論

3.1 優(yōu)化CTAB法提取徐香獼猴桃總RNA

優(yōu)化后的CTAB法所用試劑均是常規(guī)試劑，可有效降低試驗(yàn)成本[12-13]。本研究中優(yōu)化CTAB法的關(guān)鍵：(1)提取獼猴桃總RNA時(shí)樣起始量不能太大，否則提取液不能完全消化獼猴桃內(nèi)的物質(zhì)，優(yōu)化后選取的樣品質(zhì)量為0.4 g。(2)CTAB含量由2.0%提高到2.5%，CTAB是蛋白質(zhì)的變性劑，提高CTAB含量可以有效去除果實(shí)中的蛋白質(zhì)。(3)提取液中β-巰基乙醇含量由2%提高到10%，可以變性蛋白，有效抑制RNA酶的活性[14]，同時(shí)，β-巰基乙醇作為有效還原劑，能有效抑制酚類物質(zhì)及內(nèi)源酚的氧化，防止褐化效應(yīng)發(fā)生，提高RNA提取質(zhì)量。(4)三氯甲烷-異戊醇抽提次數(shù)增加至3次，三氯甲烷和異戊醇混合液使蛋白質(zhì)變性、分層，且可以去除脂類，還可使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離，從而有效回收RNA。(5)LiCl由1/3體積增加至1/2體積，高濃度LiCl在選擇性沉淀RNA的同時(shí)，可使多糖留在溶液中而不隨RNA沉淀下來[15]。LiCl沉淀需要在4 ℃放置過夜，時(shí)間長，但是RNA的產(chǎn)率高，且RNA純度高，從而降低了RNA降解的概率。LiCl本身沉淀大片段RNA效果好的特點(diǎn)使得到的RNA大片段損失很少，更適于進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)[16]。(6)70%乙醇洗滌增加至3次。多次乙醇洗滌可有效去除多糖，同時(shí)高濃度的NaCl也有助于去除多糖[17]。(7)加入 0.5 g/L 亞精胺可以有效抑制RNA酶活性?；谝陨蟽?yōu)化后的CTAB法提取的獼猴桃總RNA，完全可以滿足 RT-PCR、Northern Blotting等分子生物學(xué)試驗(yàn)的要求。

表7 ACTB、TUB和18S rRNA qRT-PCR結(jié)果

注：CT表示從基線到指數(shù)增長拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

3.2 徐香獼猴桃內(nèi)參基因的優(yōu)化

選擇一種或多種參考基因作為內(nèi)參基因用來分析qRT-PCR基因的表達(dá)，同時(shí)參考基因需要不受試驗(yàn)條件的影響[18]。qRT-PCR分析最常用的參考基因包括Actin、18S RNA、GADPH、TUB等[19]。有研究表明，相同植物的不同品種、不同組織器官以及相同組織器官在不同發(fā)育階段，同一基因的表達(dá)均會(huì)出現(xiàn)差異[20-21]。因此，根據(jù)獼猴桃的品種及不同的處理方式，選用合適的內(nèi)參基因?qū)ζ渌虻谋磉_(dá)水平進(jìn)行歸一化，才能對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正確判斷與比對。隨著分子生物學(xué)研究的廣泛開展和不斷深入，基因表達(dá)分析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于獼猴桃基因代謝調(diào)控機(jī)制的研究中，因此篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因在基因表達(dá)分析中起著關(guān)鍵作用[22]。

張慧琴等發(fā)現(xiàn)，TUB和ACTB在華特獼猴桃6種不同組織中表達(dá)均穩(wěn)定，適合作為華特獼猴桃不同組織基因表達(dá)的內(nèi)參基因[9]。本試驗(yàn)通過半定量PCR檢測ACTB、TUB、Actin、GAPDH、18S rRNA這5個(gè)內(nèi)參基因可知，ACTB在徐香獼猴桃果實(shí)中表達(dá)最穩(wěn)定。由本研究結(jié)果可知，通過熒光定量PCR進(jìn)一步確定ACTB適合作為徐香獼猴桃果實(shí)的內(nèi)參基因。因此，通過半定量PCR、qRT-PCR最終選擇ACTB作為徐香獼猴桃果肉的內(nèi)參基因，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。這些研究結(jié)果可為下一步揭示徐香獼猴桃衰老機(jī)制研究提供有力的試驗(yàn)方法。

[1]王 杰，王 全，田 娜，等. 不同植物組織RNA提取方法的比較分析[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，30(1)：76-80.

[2]湯三妹，楊 娟，周秋蓮，等. 獼猴桃RNA提取與RT-PCR[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2005(5)：67-71.

[3]陳昆松，徐昌杰，張上隆，等. 富含多糖獼猴桃果實(shí)組織中總RNA提取方法的改進(jìn)[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1998(5)：371-373.

[4]梅曉宏，高紅巖，羅云波. 提取獼猴桃果實(shí)總RNA的新方法[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2007，7(3)：55-57.

[5]劉勝洪，劉 文，劉明峰，等. 一種高效提取獼猴桃DNA和RNA的方法[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2011(9)：171-175.

[6]Nolan T，Hands R E，Bustin S A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR[J]. Nature Protocols，2006，1(3)：1559-1582.

[7]Ferradas Y，Rey L，Martinez O，et al. Identification and validation of reference genes for accurate normalization of real-time quantitative PCR data in kiwifruit[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2016，102：27-36.

[8]劉 軍. 獼猴桃GalUR基因克隆及功能分析[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[9]張慧琴，謝 鳴，肖金平，等. 獼猴桃實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27(4)：567-573.

[10]張 波. 獼猴桃脂氧合酶基因家族的功能解析及其調(diào)控[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2007.

[11]尹 慧，陳 莉，李曉艷，等. 百合葉片總RNA提取方法比較及優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，13(4)：41-45.

[12]張 濤，韓 梅，劉翠晶，等. 人參總RNA提取方法及反轉(zhuǎn)錄酶的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(8)：34-37．

[13]劉 波，張曉明，郭巧生，等. 百蕊草根系總RNA提取方法比較及優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(1)：44-46．

[14]王靜毅，鄭麗珊，冀小蕊，等. 番木瓜果皮和種子總RNA提取方法的研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，26(6)：18-20.

[15]郝福玲，劉雅莉，王躍進(jìn). 百合花瓣總RNA提取方法的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2005，25(6)：1143-1147.

[16]宋 蓓，趙 錦，劉孟軍，等. 改良CTAB-LiCl法提取棗總RNA體系的建立[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23(7)：79-83.

[17]邵 毅，羅云波，張京聲，等. 李果實(shí)高質(zhì)量RNA提取方法的比較和優(yōu)化[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(1)：57-62.

[18]Vandesompele J，de Preter K，Pattyn F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology，2002，3(7)：research0034.1- research0034.11.

[19]Thellin O，Elmoualij B，Heinen E，et al. A decade of improvements in quantification of gene expression and internal standard selection[J]. Biotechnology Advances，2009，27(4)：323-333.

[20]Andersen C L，Jensen J L，Orntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data：a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research，2004，64(15)：5245-5250.

[21]Jian B，Liu B，Bi Y R，et al. Validation of internal control for gene expression study in soybean by quantitative real-time PCR[J]. BMC Molecular Biology，2008，9：59.

[22]Gu C S，Chen S M，Liu Z L，et al. Reference gene selection for quantitative Real-Time PCR in chrysanthemum subjected to biotic and abiotic stress[J]. Molecular Biotechnology，2011，49(2)：192-197.