趙延存， 劉 坤，， 孫連波， 錢國良， 劉鳳權(quán)，

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇南京 210095)

梨是我國第三大水果，種植范圍廣，我國梨樹栽培面積約108.5萬hm2，產(chǎn)量達(dá)1 579.5萬t，約占世界總產(chǎn)量的 2/3[1-2]。梨樹腐爛病又稱爛皮病，是梨樹上危害最嚴(yán)重的枝干病害，在我國各地梨園均有發(fā)生，特別是新疆、西北、華北和東北產(chǎn)區(qū)發(fā)生危害較嚴(yán)重，對我國梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[3]。庫爾勒香梨是新疆庫爾勒地區(qū)的優(yōu)質(zhì)特色地方梨品種，因其品質(zhì)佳而遠(yuǎn)銷國內(nèi)外。然而，近年來梨樹腐爛病危害嚴(yán)重，許多香梨園中梨樹腐爛病病株率高達(dá)100%，90%的梨樹死亡植株是由腐爛病危害所致，嚴(yán)重制約了香梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。

在新疆地區(qū)，白楊樹常作為防護(hù)林栽種于梨園四周，白楊樹腐爛病也發(fā)生危害較嚴(yán)重。在病害調(diào)研過程中，發(fā)現(xiàn)白楊樹腐爛病癥狀與梨樹腐爛病癥狀極為相似，因此推測這2種樹木上的腐爛病病菌可能存在交叉侵染現(xiàn)象。已有研究表明，白楊樹腐爛病病菌可以危害蘋果樹、梨樹等[6-7]，蘋果樹和梨樹腐爛病病菌也可以危害楊樹[8-10]。為驗(yàn)證香梨腐爛病病菌和白楊樹腐爛病病菌的交叉侵染，分別采集了香梨樹及白楊樹腐爛病的樣品，對病原菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行交叉接種侵染試驗(yàn)，以確定香梨腐爛病的侵染源，為新疆香梨腐爛病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 庫爾勒香梨樹的腐爛病樣品以及種植于梨園周圍白楊樹的腐爛病樣品，均采自新疆庫爾勒地區(qū)。

1.1.2 接種材料 庫爾勒香梨枝條、葉片、果實(shí)，白楊樹枝條。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PDA)：200 g去皮馬鈴薯，切成小塊，加20 g瓊脂，1 000 mL水煮沸30 min，4層紗布過濾，濾液中加入20 g蔗糖，用水補(bǔ)足1 000 mL。

1.1.4 引物 采用ITS通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對菌株的總DNA進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 采用組織分離法，從病斑的病健交界處取樣，置于PDA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，待組織周圍長出真菌菌絲，從邊緣處打孔，將菌絲塊移植于新的PDA平板上，并對其進(jìn)行編號。利用真菌DNA提取試劑盒(OMEGA)提取每個菌株的總DNA，然后利用ITS通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測及測序，并將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對分析。

1.2.2 病原菌的驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)柯赫氏法則，采用打孔法，首先選取粗細(xì)相同的枝條，消毒后截成15 cm長的小段，上端用石蠟封口，然后用直徑為0.8 cm的打孔器在樹枝上打孔，將菌絲塊長滿菌絲的一面緊貼傷口部位，以只接種PDA培養(yǎng)基作為空白對照，然后用封口膜將傷口部位包扎好，將枝條插入滅菌的濕沙盤中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)，接種5 d后測量病斑長度，每個病菌重復(fù)3次。將從梨樹上的分離物回接梨樹枝條，同時將從白楊樹上的分離物回接白楊樹枝條，觀察其發(fā)病情況，并從發(fā)病部位再次分離病原菌，并對其進(jìn)行分子鑒定。

1.2.3 病原菌的交叉侵染試驗(yàn) 采用打孔法將梨樹上的分離物接種于白楊樹枝條，同時將白楊樹上的分離物接種于梨樹枝條，觀察其能否產(chǎn)生交叉侵染現(xiàn)象，并對發(fā)病部位再次進(jìn)行病原菌的分離和鑒定。

1.2.4 病原菌在梨樹上的致病性研究 將白楊樹上分離得到的病原物通過打孔法接種于梨樹枝條和梨果實(shí)上，并通過針刺法接種于梨樹葉片，觀察發(fā)病情況。統(tǒng)計病原菌在梨果實(shí)上發(fā)病6 d后的病斑大小。將白楊樹上的分離物在梨果實(shí)上繼代接種3代，即不斷從發(fā)病部位分離病原菌并再次接種，觀察各代病原菌的致病性變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

從梨樹樣品中共分離得到23株疑似病原菌的菌株，從白楊樹樣品中共分離得到35株疑似病原菌的菌株，將這些菌株進(jìn)行rDNA-ITS測序，并將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)梨樹樣品分離物中有8株菌株與梨腐爛病病菌具有較高的同源性，而白楊樹樣品分離物中有11株菌株與白楊樹腐爛病病菌有較高的同源性，另有9株菌株與柳樹腐爛病病菌有較高的同源性，同源性均高于99%。再結(jié)合培養(yǎng)性狀觀察，最終將這些菌株分別鑒定為梨樹腐爛病病菌(Valsamalivar.pyri)、白楊樹腐爛病病菌(Valsasordida)、柳樹腐爛病病菌(Cytosporatranslucens)。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

3種腐爛病病菌的培養(yǎng)性狀如圖1所示，A1、B1、C1分別為梨樹、白楊樹、柳樹腐爛病病菌培養(yǎng)5 d后的菌落形態(tài)，其中梨樹腐爛病病菌菌落呈白色，菌絲氣生性較弱，緊貼著培養(yǎng)基生長；白楊樹腐爛病病菌菌落呈橘紅色，菌絲氣生性較強(qiáng)，呈絲狀，不緊貼培養(yǎng)基生長；柳樹腐爛病病菌菌落呈褐綠色，菌絲的氣生性也較弱，緊貼著培養(yǎng)基生長。A2、B2、C2分別為梨樹、白楊樹、柳樹腐爛病病菌培養(yǎng) 15 d 后的菌落形態(tài)，可以看出3種菌株均已產(chǎn)生分生孢子器，突起于培養(yǎng)基上方，其中梨樹腐爛病病菌的分生孢子器呈墨綠色，較大；白楊樹及柳樹腐爛病病菌的分生孢子器呈白色，白楊樹腐爛病病菌的分生孢子器較大也比較密集， 柳樹腐爛病病菌的分生孢子器較小，且比較稀疏。

2.3 病原菌的回接驗(yàn)證及交叉侵染試驗(yàn)

將梨樹、白楊樹和柳樹腐爛病病菌分別回接到各自寄主的枝條上，發(fā)病率分別為100.0%、73.7%、56.3%(表1)，其病害癥狀如圖2所示，與所采集樣品的病害癥狀相似。從發(fā)病部位再次分離病菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子鑒定，結(jié)果證實(shí)分離物與接種的病原菌相同，依據(jù)柯赫氏法則證明從所采集樣品上獲得的分離物即為這2種枝條的致病菌。

將已驗(yàn)證的病原菌進(jìn)行交叉侵染試驗(yàn)，即選取梨樹腐爛病病菌接種白楊樹枝條，再選取白楊樹、柳樹腐爛病病菌接種梨樹枝條，觀察交叉接種后的發(fā)病情況。由表1可知，白楊樹、柳樹腐爛病病菌接種到梨樹枝條后發(fā)病率分別為 45.8%、63.0%，而梨樹腐爛病病菌接種白楊樹枝條后發(fā)病率僅為 8.9%。從以上枝條的發(fā)病部位再次分離病菌，并進(jìn)行形態(tài)及分子鑒定，結(jié)果證實(shí)分離物與接種的病原菌相同，說明這些病原菌之間可以交叉侵染。

表1 病原菌回接梨樹、白楊樹枝條的發(fā)病率

2.4 病原菌在梨樹上的致病性研究

為研究白楊樹上的腐爛病病菌對梨樹的危害，將其與梨樹腐爛病病菌一起接種于梨樹，觀察致病情況。將3種病原菌接種于梨樹枝條，由梨樹、白楊樹、柳樹腐爛病病菌引起的發(fā)病率分別為100.0%、45.8%、63.0%；將3種病原菌接種梨樹葉片，發(fā)病率分別為100.0%、6.7%、44.4%，且柳樹、白楊樹腐爛病病菌在梨樹葉片上引起的病斑較小(圖3)；將3種病原菌接種于庫爾勒香梨果實(shí)上，致病率均為100%，病害癥狀如圖4所示，白楊樹、柳樹腐爛病病菌引起的病害癥狀顏色均較深，其病斑與梨樹腐爛病病菌引起的病害癥狀完全不同，三者的病斑大小表現(xiàn)為梨樹腐爛病病菌>柳樹腐爛病病菌>白楊樹腐爛病病菌。綜合分析3種病原菌在梨樹枝條、葉片和果實(shí)上的致病情況，梨腐爛病病菌在梨樹上的致病性最強(qiáng)，其次為柳樹腐爛病病菌，而白楊樹腐爛病病菌的致病力最弱。

為進(jìn)一步研究白楊樹上的腐爛病病菌侵染梨樹后其致病力的變化情況，將梨樹果實(shí)發(fā)病后分離獲得的菌株作為2代進(jìn)行接種，將再次分離得到的菌株作為3代進(jìn)行接種，觀察繼代接種后病原菌的致病力變化情況。由圖5可知，柳樹腐爛病病菌的2代致病力有所下降，但3代致病力又有所上升，且高于1代的致病力。白楊樹腐爛病病菌的致病力則逐代增強(qiáng)。因此，推測這2種病菌反復(fù)侵染梨樹后，其致病力會逐漸增強(qiáng)。

3 討論

腐爛病是危害果樹和林木枝干的主要病害，一些來源于不同寄主的腐爛病病原菌能夠侵染其他寄主植物，引起危害[11-14]。本試驗(yàn)通過柯赫氏法則、ITS序列和菌落形態(tài)特征確定了引起庫爾勒地區(qū)香梨梨樹腐爛病的病原菌為Valsamalivar.pyri，引起白楊樹腐爛病的病原菌為Valsasordida和Cytosporatranslucens。本研究發(fā)現(xiàn)，白楊樹上分離得到的2種腐爛病病菌均能夠成功侵染香梨梨樹枝條，這與郭眾仲等的研究結(jié)果[13]一致。但是，本研究發(fā)現(xiàn)分離鑒定的梨樹腐爛病病菌對白楊樹枝條的侵染成功率僅為8.9%，且病斑擴(kuò)展較小。周玉霞等研究發(fā)現(xiàn)，梨樹腐爛病病菌不能侵染白楊樹枝條[15]，本研究的結(jié)果與之相符，這表明白楊樹對梨樹腐爛病病菌的侵染具有較強(qiáng)的抵抗能力。

雖然在室內(nèi)試驗(yàn)中白楊樹上的腐爛病病菌可以侵染梨樹枝條，但是其接種發(fā)病率和致病力均明顯低于梨樹腐爛病病菌。另外，梨樹腐爛病病菌在梨樹各類傷口上均表現(xiàn)出強(qiáng)大的生存競爭能力，限制了其他腐爛病病菌的定殖侵染。但繼代接種試驗(yàn)結(jié)果表明，白楊樹腐爛病病菌的致病力可以在梨樹寄主上逐代變強(qiáng)。長期疏于對果園周邊白楊樹腐爛病的管理和防治，可能導(dǎo)致其成為梨樹腐爛病的潛在侵染源。

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