苯并芘對(duì)鯉魚腎臟SOD和CAT的影響

趙莎莎， 袁華根

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類的常見污染物，主要來源于煤、石油等燃燒產(chǎn)生的煙氣、尾氣以及焦化煉油等工業(yè)廢水中，具有致癌、致畸和致突變型特性。在水環(huán)境中通過重點(diǎn)監(jiān)測，PAHs在體內(nèi)代謝時(shí)通過自身或中間代謝物氧化產(chǎn)生大量活性氧自由基[1]，進(jìn)而產(chǎn)生DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等毒性反應(yīng)[2]。苯并芘由于其性質(zhì)穩(wěn)定、致癌性性強(qiáng)所以是PAHs的典型代表[3]。一些研究表明，苯并芘是高活性致癌劑，而并不是直接的致癌物，必須與細(xì)胞微粒體中的混合功能氧化酶相互作用才具有致癌性。隨著苯并芘濃度的增加，癌癥的發(fā)生率也會(huì)明顯提高，且腫瘤的潛伏期也會(huì)明顯縮短，苯并芘不僅會(huì)引發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生癌癥而且還會(huì)導(dǎo)致子代發(fā)生腫瘤癌變，不但會(huì)造成動(dòng)物免疫功能下降，而且也會(huì)造成胚胎畸形甚至死亡[4-9]。

魚類體內(nèi)抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)。其中SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，它通過上述反應(yīng)可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫[10]。CAT則是催化體內(nèi)廢物過氧化氫，將其分解為完全無害的水，減少對(duì)機(jī)體的損害[11]。腎臟是機(jī)體的重要器官，承擔(dān)機(jī)體排泄功能，可排除蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物和對(duì)機(jī)體有害的毒物和廢物，以調(diào)節(jié)體液平衡和調(diào)節(jié)電解質(zhì)酸堿平衡；分泌生物活性物質(zhì)，同時(shí)可以通過重吸收功能保留水分及其他有用物質(zhì)[12]。在魚類腎臟中含有豐富的抗氧化酶，因此通過研究不同濃度的苯并芘對(duì)魚類腎臟的SOD、CAT酶含量的影響來描述水體受污染的程度。目前，已有很多關(guān)于海洋魚類的報(bào)道[13～14]，但是在淡水魚方面的研究較少，而鯉魚又是淡水魚中的代表，希望通過研究苯并芘對(duì)鯉魚的抗氧化酶的影響為改善水環(huán)境的污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)時(shí)間：2016年6月；試驗(yàn)地點(diǎn)：江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)魚選購自無污染的漁場，所購鯉魚來自同一魚池，平均體質(zhì)量為(25.16±2.15)g，經(jīng)5%食鹽水消毒后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室[15]。

1.2 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)UV 2000(優(yōu)尼科)；勻漿機(jī)ART、苯并芘(BaP)，購自美國AccuStandard公司；助溶劑二甲基亞砜(DMSO)，購自美國Amreccr公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純級(jí)別。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 暴露 所有試驗(yàn)用魚在去氯自來水中培養(yǎng)，通過對(duì)水中成分分析，水中的重金屬元素幾乎沒有或者不能被監(jiān)測出來，水質(zhì)滿足鯉魚生存所需的要求。馴養(yǎng)2周后，隨機(jī)分組，每個(gè)處理組4尾。分別置于長×寬×高為100 cm×70 cm×50 cm的塑料缸中，盛水200 L/缸。試驗(yàn)時(shí)每天更換用水，換水量為原來的1/2，以便濃度保持基本一致。試驗(yàn)期間用充氣泵連續(xù)進(jìn)行充氣，每天按時(shí)投放飼料，水溫基本控制在約23 ℃，自然光照，試驗(yàn)進(jìn)行30 d，并每5 d換1次水，徹底清洗水箱。將苯并芘溶于水中，由于苯并芘的溶解度比較小，所以在水中再加入助溶劑二甲基亞砜(DMSO)。4個(gè)處理組分別接受苯并芘濃度為0、0.1、0.5、1.0 μg/L的染毒，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行，對(duì)照組只投放二甲基亞砜(DMSO)[16]。

1.3.2 取樣及樣品處理 將魚撈出迅速解剖魚體取出腎臟，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水沖洗表面血液，在濾紙上除去多余的液體后，-4 ℃保存，按質(zhì)量體積比1 g ∶10 mL加入0.9%生理鹽水充分勻漿，4 ℃下，5 000 r/min離心約10 min，去上清液進(jìn)行酶活力分析和蛋白質(zhì)含量測定。每尾魚都獨(dú)立作為一個(gè)樣本。

1.4 酶活性的測定

1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的活性測定 采用黃嘌呤氧化酶法[17～18]。SOD活性的定義：1 mg蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制表達(dá)率達(dá)50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽單位(NU)。而鯽魚腎臟SOD活性用SOD試劑盒測定。

測定原理：腎臟SOD活性A(SOD)/(NU·mg)=2{(D對(duì)照管-D測定管)/D對(duì)照管}×(反應(yīng)液總體積/樣品量)/蛋白質(zhì)含量。

1.4.2 過氧化氫酶(CAT)的活性測定[19]CAT活性的定義：1 mg蛋白質(zhì)1 min分解底物過氧化氫的相對(duì)量為1個(gè)活力單位。

測定原理：CAT分解H2O2的反應(yīng)通過加入鉬酸銨中止反應(yīng)，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定其生成量，可計(jì)算出CAT活力。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測定

樣品中蛋白質(zhì)含量用Lowry法測定，以牛血清白蛋白為參照[18]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0版軟件進(jìn)行單因素方差分析處理，并用CORREL進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并芘對(duì)鯉魚腎臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

不同濃度的苯并芘30 d后對(duì)鯽魚腎臟中SOD的影響見圖1。由圖1可見，不同濃度苯并芘水溶液暴露30 d后，0.1、0.5、1.0 μg/L濃度組分別比對(duì)照組高6.355 U/mg、低 0.415 U/mg、低2.985 U/mg。Excel軟件中的CORREL函數(shù)相關(guān)性分析表明，鯉魚在含有不同濃度苯并芘的水中暴露 30 d 后，SOD活性與苯并芘濃度(r=-0.81)呈負(fù)相關(guān)。苯并芘濃度在 0.1 μg/L 與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；在濃度為 1.0 μg/L 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.2 苯并芘對(duì)鯉魚腎臟過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖2可見，不同濃度苯并芘水溶液暴露30 d后，0.1、0.5、1.0 μg/L濃度組分別比對(duì)照組高1.155 U/mg、低 0.993 U/mg、低1.678 U/mg。Excel軟件中的CORREL函數(shù)相關(guān)性分析表明，鯉魚在含有不同濃度苯并芘的水中暴露 30 d 后，CAT活性與苯并芘濃度(r=-0.92)呈負(fù)相關(guān)，且在濃度為1.0 μg/L時(shí)，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論

苯并芘屬多環(huán)芳香烴類的環(huán)境污染物，在自然界分布廣、致癌性強(qiáng)，通常將其作為環(huán)境致癌物的代表，是主要的環(huán)境污染檢測對(duì)象[1，3]。

水體中的污染物主要是PAHs，苯并芘是PAHs典型的一種[3]。因此，本試驗(yàn)通過對(duì)不同濃度的苯并芘對(duì)鯽魚腎臟SOD、CAT含量影響的研究，以期為水體監(jiān)測提供一些數(shù)據(jù)。據(jù)有關(guān)研究試驗(yàn)表明，在抗氧化防御系統(tǒng)中，對(duì)低濃度污染物的感染，酶的活力或活性物質(zhì)的含量升高；當(dāng)污染程度不斷加大，對(duì)機(jī)體已經(jīng)構(gòu)成損害，那么抗氧化酶的活力或活性物質(zhì)的含量則會(huì)下降[25]。本試驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)和結(jié)論與之相同，即當(dāng)苯并芘濃度較低時(shí)(0.1 μg/L)，SOD和CAT的活性均高于對(duì)照組，當(dāng)苯并芘濃度逐漸加大時(shí)，SOD和CAT的活性均低于對(duì)照組。且其相關(guān)性分別為-0.81和-0.92，說明變化整體是呈下降趨勢的，這可能因?yàn)楫?dāng)機(jī)體受到外來物質(zhì)感染時(shí)，刺激機(jī)體的抗氧化性防御機(jī)制，使得抗氧化酶SOD和CAT大量產(chǎn)生，將體內(nèi)自由基清除，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用；但是隨著感染濃度的加大，機(jī)體的抗氧化防御作用有限，可能造成活性氧自由基的積累和對(duì)細(xì)胞膜的損傷，降低機(jī)體的健康水平[19]。

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