王立娜 張盼盼 王 穎 桑 曉 王巖巖 王集會

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學研究生院，山東 濟南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東 濟南 250355 )

土鱉又名土元、地鱉，具有活血化瘀的功效?，F(xiàn)代藥學研究表明, 土鱉及其提取物具有顯著的抗血栓、抗凝血、抑制血小板聚集與抗腫瘤功效[1，2]。球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)，一種蟲生真菌，屬于半知菌類，在生長的過程中可產(chǎn)生多種次生代謝物質(zhì)，蛋白質(zhì)、白僵菌素、黃酮，具有一定的抗腫瘤活性，其孢子接觸昆蟲后，生長菌絲會在適宜的生長條件下萌發(fā)，從而侵入蟲體發(fā)酵。生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥研究中的最新運用——蟲類中藥的發(fā)酵，就是利用微生物在生長的過程中產(chǎn)生的酶系等對蟲類中藥中所含有的蛋白、白僵菌素、黃酮等成分進行轉(zhuǎn)化修飾，從而生成藥效活性更強的物質(zhì)[3]。本實驗把球孢白僵菌作為發(fā)酵真菌，將其接種在土鱉蟲粉上，應用新型固體雙向發(fā)酵模式對土鱉蟲粉進行深層加工，將二者發(fā)生相互作用后，轉(zhuǎn)化修飾的活性成分蛋白質(zhì)進行研究。將發(fā)酵前后土鱉蟲通過超聲提取，比較蛋白質(zhì)的含量差異，以及采用MTT法比較發(fā)酵前后抗肝癌活性的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材

土鱉蟲粉和發(fā)酵土鱉蟲粉(山東中醫(yī)藥大學實驗室自制，批號20150505)；陽性藥(注射用順鉑100 μg·mL-1，齊魯制藥有限公司)

1.1.2儀器

UV9100B 型可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；FA1004N 型電子分析天(上海精密儀器有限公司)；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；KQ-500E 型聲波清洗器(昆山市 超聲儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；雙人單面凈化工作臺(AIR TECH，蘇凈集團安泰公司)；Memmert二氧化碳培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；臺式離心機(SIGMA 1-B 型)；酶標儀(Multiskan MK3,Thermo Scientific)；Nikon 倒置顯微鏡(TS100，Japan)；超低溫冰箱(DW-HL668，中科美菱低溫科技有限責任公司)。

1.1.3試劑

牛血清蛋白、福林酚(國藥集團化學試劑有限公司)；碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀、無水硫酸銅皆為分析純；1640 細胞培養(yǎng)基與胎牛血清(Hyclone,賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；PBS(磷酸鹽緩沖液)；青霉素鏈霉素混合液雙抗；胰酶細胞消化液(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.4實驗細胞

肝癌細胞株(7402),由山東省立醫(yī)院提供。

1.2 方法

1.2.1改良Lowry 法測定蛋白質(zhì)含量[4，5]

1.2.1.1 制備標準牛血清蛋白溶液曲線

精密稱取0.020 0 g 牛血清蛋白至燒杯中，用適量蒸餾水溶解，移至于規(guī)格為100 mL 的容量瓶中，定容，搖勻，即得0.2 mg·mL-1的標準蛋白溶液。精密量取標準蛋白質(zhì)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分別置于試管中，補充水至1.0 mL，然后加入5 mL堿性銅溶液，搖勻，在室溫下放置10 min，迅速加入0.5 mL福林酚試劑,搖勻，室溫凈置30 min，顯色后，在紫外分光光度計上于波長650 nm 處測定各樣品的吸光度，作出吸光度對蛋白質(zhì)含量的關(guān)系圖，得到直線回歸方程Y=2.363 9X+0.009 5,r=0.999 3。

1.2.1.2 供試品溶液的測定

精密稱取未發(fā)酵和發(fā)酵土鱉蟲粉各0.5000 g 至燒杯中，分別向2 個燒杯中加入15 mL蒸餾水，超聲提取10 min，抽濾，傾出濾液，重復上述步驟2次，將3次所得抽濾液混合轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容，搖勻。分別精密量取2.0 mL發(fā)酵前后的土鱉蟲水提液于10 mL 容量瓶中，定容，搖勻，精密量取此稀釋液1 mL于試管中，加5 mL堿性銅溶液，搖勻，按照1.2.1.1項下方法，測定吸光度，平行測定3 次，求平均值，通過標準曲線計算出土鱉蟲水提液中蛋白質(zhì)的含量結(jié)果詳見表1。

1.2.2MTT 分析法測定抗腫瘤活性

1.2.2.1 細胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的肝癌細胞，迅速投入預先加熱到37 ℃滅菌水中攪拌，待凍存液溶化后，用含10%胎牛血清、1%雙抗的1640 培養(yǎng)基3 mL在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2.2 接種

等細胞生長至80%融合時，用PBS 沖洗3 遍，然后用600 μL 0.25%的胰酶細胞消化液(含0.02%EDTA)消化1 min 左右，吸去消化液，加上3 mL 培養(yǎng)基，吸取2 mL 含細胞的培養(yǎng)基至加樣槽并加上4 mL 不含細胞培養(yǎng)基，用排槍吹打上百下，使細胞分布均勻，以每孔100 μL 接種于96 孔板中，空出外圍。

1.2.2.3 配藥

用電子分析天平分別稱取0.010 0 mg 發(fā)酵前后的土鱉蟲粉至10 mLEP 管中，用移液槍移取5 mL 不含血清的1640 培養(yǎng)液至EP 管中溶解藥物，然后用濾頭和注射器將藥物濾至另一EP 管中，用移液槍分別移取70、140、210、280、350μL 藥物至1.5 mL滅菌EP管中，加1640 培養(yǎng)基至700 μL，使藥物濃度分別為200、400、600、800、1000 μg·mL-1。

1.2.2.4 加藥

細胞培養(yǎng)24 h，待96 孔板中的細胞長滿單層后，棄去培養(yǎng)基，空白對照組加100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基，對照組加100 μL陽性藥，其他給藥組每孔分別加入含不同濃度藥物的1640培養(yǎng)基100 μL，每個濃度的藥物加5 孔。然后細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2.5 MTT 法測定細胞存活率

加藥24 h 后，避光條件下在每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL 于培養(yǎng)箱內(nèi)反應4 h。4 h后，吸出每孔的藥物和MTT，然后每孔加入100 μL DMSO，在空白孔加3個DMSO作為調(diào)零組，10 min內(nèi)用酶標儀于492 nm測定A 值，計算細胞抑制率。計算公式：細胞抑制率(%)=[1-(加藥組A492-調(diào)零組A492)/(空白對照組A492-調(diào)零組A492)]×100%。結(jié)果詳見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 土鱉蟲水提液中蛋白質(zhì)的含量

表1 土鱉蟲發(fā)酵前后可溶性蛋白的含量對比Table 1 The content of soluble protein before and after fermentation of Eupolyphagasinesis Walker

*P<0.01

2.2 土鱉蟲發(fā)酵前后抗肝癌活性

從表2可以看出，發(fā)酵后的土鱉蟲對肝癌細胞有一定的抑制作用，且多為高濃度的抑制率較高，并且劑量與抑制率呈正相關(guān)。而發(fā)酵前的土鱉蟲對肝癌細胞的抑制率很小，甚至是沒有抑制作用。發(fā)酵前后的土鱉蟲對肝癌細胞的抑制作用具有明顯的差異，與空白對照組相比其差異亦顯著。

表2 土鱉蟲發(fā)酵前后的吸光度及對肝癌的抑制率( X±s)Table 2 The absorbance of Eupolyphagasinesis Walker before and after fermentation and inhibition rate of hepatoearcinoma (X±s)

3 討 論

本研究中發(fā)酵后的土鱉蟲中，其蛋白質(zhì)的濃度與肝癌細胞的存活率存在負相關(guān)關(guān)系，高濃度組對肝癌細胞的抑制率比低濃度高。而且土鱉蟲發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量大于發(fā)酵前，表明經(jīng)發(fā)酵處理可達到改變有效成分的含量、增大應用范圍、增強藥效特異性、提高藥效的作用。

本實驗采用MTT法對不同濃度發(fā)酵前后的土鱉蟲，其作用下的肝癌細胞的24 h 生長情況進行了觀察，結(jié)果表明土鱉蟲發(fā)酵前后對肝癌細胞的抑制作用具有明顯的差異，發(fā)酵后的抑制作用顯著高于發(fā)酵前。并且濃度越高抑制率越高。但土鱉蟲中除含有蛋白質(zhì)之外，還含有其他的有效成分，如多糖，核酸等，也可能對肝癌細胞有抑制作用，具體的作用機制還不清楚，因此，這些問題有待于進一步的研究。

[1] 葛鋼鋒，余陳歡，吳巧鳳.土鱉蟲醇提物對體外腫瘤細胞增殖的抑制作用及其機制研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(03):826～828.

[2] 王立娜,馬明珠,王穎,王集會. 中藥土鱉蟲發(fā)酵前后活性成分的含量對比[J]. 湖南中醫(yī)雜志,2016,32(08):200～202.

[3] Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A l,, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. J Biol Chem,1951,193:265～269.

[4] 董純定. 生化藥物分析 [M]. 南京 ：中國藥科大學出版社 ,1995:142～150.

[5] 張盼盼,張秀云,王集會,等. 發(fā)酵全蝎粉殺酶前后各活性部位蛋白含量及抗癌活性研究[J].福建中醫(yī)藥,2014,04:50～51.