□ 馬艷玲 李海賢 翁 萍 劉澤璇 許小慶 曾 榮 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院

2000年后的海洋放線菌的研究受到極大的關(guān)注，強(qiáng)烈地吸引著各個領(lǐng)域的研究者[1]。其可以合成些具有結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣且生物活性廣泛的新型化合物[2-3]，為一些新型的抗生素的發(fā)現(xiàn)提供了珍貴的資源指導(dǎo)。

在人體機(jī)體內(nèi)，有著多種酰基轉(zhuǎn)移酶，除了催化蛋白質(zhì)的?；腿ヵ；?，還發(fā)揮著其他重要功能，例如脂酰輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，所催化的膽固醇的酯化反應(yīng)無論在細(xì)胞還是個體水平的膽固醇代謝平衡中都發(fā)揮了極其重要的作用是細(xì)胞內(nèi)已知的唯一一個催化游離膽固醇與長鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯的酶，是參與吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存膽固醇的一個及其重要的酶，可直接影響血液中膽固醇水平[4]。如何表達(dá)這些潛在的基因簇來解決食物污染及耐藥性問題一直是現(xiàn)在的重要研究方向，異體表達(dá)這些基因簇可以成為解決這個問題的方法之一[5-6]。因此通過生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究海洋放線菌酰基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆，能夠使海洋放線菌酰基轉(zhuǎn)移酶更好地產(chǎn)生各種獨(dú)特的具有生物活性的代謝物和酶。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源

海洋放線菌Salinispora CNS-205，為本實(shí)驗室保存。

1.1.2 主要試劑

大腸桿菌DH10B；限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量marker；DNA聚合酶。DNA提取試劑盒，T4DNA 連接酶，凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒，均購買自天根生化科技（北京）有限公司；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系：H2O 28.5 μL，5×FAST HiFidelity PCR Buffer 10 μL， 20×FAST PCR Enhancer 2.5 μL， DMSO 2 μL，Template 2 μL，PrimerL 2 μL， PrimerR 2 μL， FAST HiFidelity polymerase 1 μL。PCR程序：升溫90 ℃，2 min；DNA變性95 ℃，30 s；退火53 ℃，30 s；引物延伸72 ℃，2 min；30周期后，72 ℃維持10 min，電泳。PCR產(chǎn)物的片段為雙鏈平末端，需通過酶切的方式將粘性末端暴露出來。酶切反應(yīng)體系如下（50 mL反應(yīng)體系）。

水 11 mL

EcoR I Buffer 5 mL

PCR回收樣品 30 mL

EcoR I 2 mL

Nde I 2 mL

然后放入37 ℃水浴鍋中水浴2 h，經(jīng)膠回收后的PCR產(chǎn)物連入pUC18載體。酶連體系（20 mL反應(yīng)體系）。

滅菌水 6 mL

PCR樣品回收片段 10 mL

PUC-18回收片段 1 mL

10×T4 DNA Ligase Buffer 2 mL

T4 DNA Ligase 1 mL

1.2.2 酶切驗證

用EcoR I和NdeI酶切，酶切反應(yīng)體系如下（10 mL反應(yīng)體系）。

水 6.2 mL

EcoR I Buffer 1 mL

抽提的質(zhì)粒樣品 2 mL

EcoR I 0.4 mL

Nde I 0.4 mL

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

以海洋放線菌總DNA為模板, 用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，再EcoRI 和NdeI酶切回收。原PCR產(chǎn)物的目的條帶應(yīng)位于大約1100bp處，然而酶切回收后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測得出在約1100bp處有一條亮帶（如圖1所示）,有待進(jìn)一步鑒定。

圖1 PCR電泳

2.2 重組質(zhì)粒的驗證

圖2中第一個條帶在約2 700 bp左右，為載體的酶切條帶；第二個條帶位于1 100 bp左右，為目的基因的酶切條帶。得出該重組質(zhì)粒后，測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶切驗證

3 討論

凝膠回收中向吸附柱加入液體應(yīng)垂直且正中加入，否則會對實(shí)驗結(jié)果產(chǎn)生影響，特別是加入洗脫液時會決定實(shí)驗的成敗，同時避免桶破吸附柱。

[1]田新朋,張偲,李文均.海洋放線菌研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報,2011(2)：161-169.

[2]KinSLam.Discovery of Novelmetabolites from Marine Acctinomycete[J].Curr Opin Microbiol,2006(9)：245-251.

[3]馬艷玲.海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建和功能基因的克隆及序列分析[D].武漢：華中師范大學(xué),2011.

[4]范東東,孫銘娟,王梁華,焦炳華.?；D(zhuǎn)移酶研究[J].生命的化學(xué) ,2008(6)：701-703.

[5]馬艷玲,鄧海魏,箐箐,等.稀有海洋放線菌Salinispora arenicola非核糖體肽合成酶和鹵代酶生物合成基因簇核心區(qū)的克隆及序列分析[J].生物技術(shù)通報 ,2011(2)：157-162.

[6]JW.-H.Li, JohnC.Vederas.Drug Discovery and NaturalProd-ucts：End of an Era or an Endless Frontier[J].Science,2009(10)：161-165.