劉容枝

·專(zhuān)家筆談·

結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑及相關(guān)問(wèn)題的探討

劉容枝

結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑在結(jié)核病輔助診斷中的作用已寫(xiě)入相關(guān)指南。WHO對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)試劑在臨床的應(yīng)用價(jià)值提出了質(zhì)疑。作者分析了結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑在中國(guó)的注冊(cè)現(xiàn)狀并剖析了可能的原因；同時(shí)，對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)中的主要原材料、分析性能，以及臨床試驗(yàn)中的重點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行了闡述。

分枝桿菌，結(jié)核； 抗體； 試劑盒，診斷； 臨床試驗(yàn)； 基于問(wèn)題的學(xué)習(xí)

世界衛(wèi)生組織(WHO)2017年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，結(jié)核病是全世界的第九大死因，在傳染性疾病中排名第一，超過(guò)艾滋病；中國(guó)結(jié)核病患者的例數(shù)位居世界第三，并且是世界三大耐多藥結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一[1]。這些數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)結(jié)核病的防控壓力依然不容樂(lè)觀，正確診斷結(jié)核病(特別是菌陰結(jié)核病)已成為結(jié)核病防控工作中的重要環(huán)節(jié)。

結(jié)核病的診斷需要結(jié)合患者癥狀、體征、影像學(xué)檢查結(jié)果，以及其他多種輔助診斷方法進(jìn)行綜合判斷。常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括：(1)病原學(xué)檢測(cè)方法：如涂片、培養(yǎng)及核酸檢測(cè)等；(2)血清學(xué)檢測(cè)方法：抗原檢測(cè)、抗體檢測(cè)及γ干擾素檢測(cè)等[2]。

根據(jù)我國(guó)法律規(guī)定，結(jié)核抗體檢測(cè)試劑按照三類(lèi)體外診斷試劑進(jìn)行管理。截至目前，經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準(zhǔn)的國(guó)產(chǎn)結(jié)核抗體檢測(cè)試劑30個(gè)、抗原檢測(cè)試劑3個(gè)，進(jìn)口結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒3個(gè)，檢測(cè)方法涉及膠體金法、酶聯(lián)免疫方法、化學(xué)發(fā)光法及蛋白芯片法；其中涉及膠體金法試劑約占70%，這主要與結(jié)核抗體檢測(cè)試劑在我國(guó)的臨床定位有關(guān)。我國(guó)結(jié)核病患者多分布在偏遠(yuǎn)農(nóng)村，基層醫(yī)療條件相對(duì)落后。而膠體金法操作簡(jiǎn)單，對(duì)一線技術(shù)人員操作要求較低，比較適于基層使用。已上市的試劑盒中，檢測(cè)靶標(biāo)大多為IgG抗體和總抗體，這與病毒類(lèi)抗體檢測(cè)試劑存在明顯差異。病毒類(lèi)抗體檢測(cè)試劑的檢測(cè)靶標(biāo)包括IgM抗體、IgG抗體及總抗體等。究其原因，結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)感染菌，侵入人體后可長(zhǎng)期潛伏，由感染至發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，而IgM抗體在結(jié)核分枝桿菌感染者體內(nèi)存在時(shí)間較短。病毒感染人體后激發(fā)的主要是體液免疫反應(yīng)，IgM抗體在急性反應(yīng)期會(huì)顯著升高，因此，IgM抗體檢測(cè)對(duì)于病毒早期感染的輔助診斷有較大意義。

2011年，WHO發(fā)布了一項(xiàng)政策建議，指出目前商業(yè)化的結(jié)核病血液學(xué)檢測(cè)試劑常常導(dǎo)致結(jié)核病的誤診和不當(dāng)治療[3]。因此，WHO敦促各國(guó)禁止使用不準(zhǔn)確的和未經(jīng)批準(zhǔn)的血液檢測(cè)方法。為加強(qiáng)該類(lèi)試劑的管理，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局參考WHO的上述建議，于2012年發(fā)布了《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)核病血液檢測(cè)試劑監(jiān)管有關(guān)事宜的通知》，委托中國(guó)食品藥品檢定研究院組織開(kāi)展我國(guó)結(jié)核病血液檢測(cè)試劑的抗原來(lái)源和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等有關(guān)情況的調(diào)研[4]。自2014年起，基本沒(méi)有新的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行注冊(cè)申報(bào)。筆者認(rèn)為，該類(lèi)試劑注冊(cè)申報(bào)減少的原因可能有以下幾點(diǎn)：第一，近幾年來(lái)，中國(guó)醫(yī)療器械注冊(cè)法規(guī)進(jìn)行了較大修訂，國(guó)家加強(qiáng)了對(duì)醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)的監(jiān)管，對(duì)臨床試驗(yàn)的科學(xué)性和規(guī)范性提出了更高要求，生產(chǎn)企業(yè)需要適應(yīng)；第二，從臨床實(shí)際應(yīng)用來(lái)看，病原學(xué)檢測(cè)與血清學(xué)檢測(cè)相比，對(duì)結(jié)核病的診斷可能具有更大價(jià)值。隨著結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑被臨床普遍接受，臨床對(duì)血清學(xué)抗體檢測(cè)試劑的需求有所下降，生產(chǎn)企業(yè)根據(jù)市場(chǎng)風(fēng)向調(diào)整了產(chǎn)品布局；第三，國(guó)家對(duì)結(jié)核病管理的重點(diǎn)在政策層面發(fā)生了較大變化，正在修訂的結(jié)核病臨床診療指南也有較大變化，這些都會(huì)影響生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品布局。

結(jié)核抗體檢測(cè)試劑采用常規(guī)的抗原抗體反應(yīng)原理，是一種比較成熟的免疫學(xué)檢測(cè)方法。筆者回顧分析了技術(shù)審評(píng)中的一些個(gè)人體會(huì)，總結(jié)如下。

一、主要原材料研究

結(jié)核抗體檢測(cè)試劑最主要原材料為抗原?？乖募兌戎苯佑绊懏a(chǎn)品的檢測(cè)特異度；抗原的包被總量直接影響產(chǎn)品的檢測(cè)敏感度。其次，固相載體的負(fù)載容量及酶標(biāo)二抗的活性均會(huì)影響產(chǎn)品的檢測(cè)敏感度和特異度。目前，該類(lèi)試劑所用抗原基本為大腸埃希菌表達(dá)的重組抗原。該類(lèi)抗原純度高，一般包括結(jié)核分枝桿菌引起特異性抗體反應(yīng)的抗原片段，這就保證了在有限的固相表面包被盡可能多的有效抗原表位。但重組抗原也存在一定缺陷：重組抗原一般為原核表達(dá)，缺少真核表達(dá)具有的糖基化等修飾，可能會(huì)影響抗原的抗原性；另外，原核表達(dá)會(huì)引入宿主蛋白，可能導(dǎo)致非特異性交叉反應(yīng)，而降低產(chǎn)品的檢測(cè)特異度。固相載體多為微孔，微孔面積有限，因此，近年來(lái)出現(xiàn)了蛋白芯片，可以擴(kuò)大抗原的負(fù)載面積，增加檢測(cè)的敏感度；但蛋白芯片較為昂貴，結(jié)果判讀更為復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)檢測(cè)人員的要求較高。

通常采用企業(yè)參考品來(lái)選擇合適抗原。企業(yè)參考品的制備一般采用至少2家已上市試劑盒篩選臨床血清或血漿，選擇幾種試劑同時(shí)檢測(cè)為陰性或陽(yáng)性的臨床血清或血漿，獲得一系列不同滴度的結(jié)核抗體陽(yáng)性和陰性血清或血漿，作為企業(yè)陽(yáng)性參考品和陰性參考品。陽(yáng)性參考品建議包括臨界陽(yáng)性、中等陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性樣本，以覆蓋臨床可能出現(xiàn)的各種濃度的樣本，便于選擇具有高敏感度的抗原；陰性參考品則建議包括可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的、其他病原體陽(yáng)性的臨床樣本，便于選出具有高特異性的抗原。因此，筆者建議申請(qǐng)人在該部分資料中，應(yīng)詳細(xì)描述企業(yè)參考品制備和主要原材料選擇的詳細(xì)資料，包括試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)和結(jié)論等。

二、分析性能評(píng)估

結(jié)核抗體檢測(cè)試劑為定性檢測(cè)試劑，應(yīng)該包括定性檢測(cè)試劑的常見(jiàn)項(xiàng)目，如陰性符合率、陽(yáng)性符合率、最低檢測(cè)限、精密度、特異度和干擾等試驗(yàn)。陰性符合率一般采用陰性企業(yè)參考品來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，陽(yáng)性符合率一般采用陽(yáng)性參考品進(jìn)行試驗(yàn)。最低檢測(cè)限一般采用系列稀釋的血清或血漿樣本進(jìn)行試驗(yàn)，確定能檢出陽(yáng)性的最高稀釋倍數(shù)。特異度重在驗(yàn)證是否與臨床表現(xiàn)相似的其他疾病具有交叉反應(yīng)性。干擾試驗(yàn)一般對(duì)血液樣本中的常見(jiàn)干擾進(jìn)行驗(yàn)證。筆者建議申請(qǐng)人參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)文件，如由國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)出版的相關(guān)評(píng)價(jià)方案等，科學(xué)合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行驗(yàn)證。

三、臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)基于3個(gè)基本原則：倫理原則、依法原則和科學(xué)原則[5]。具體而言，建議注意以下幾點(diǎn)。第一，倫理批件。臨床機(jī)構(gòu)應(yīng)出具蓋有臨床機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)公章的正式的倫理批件，如臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)確實(shí)沒(méi)有倫理委員會(huì)，應(yīng)出具有關(guān)倫理的相關(guān)說(shuō)明。新舊體外診斷試劑臨床試驗(yàn)指導(dǎo)原則在倫理方面有較大的變化，企業(yè)在臨床試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意。第二，臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。體外診斷試劑臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局的資質(zhì)認(rèn)可。在醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)目錄發(fā)布之前，該類(lèi)試劑的臨床試驗(yàn)應(yīng)在省級(jí)以上衛(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行。建議該類(lèi)試劑盡可能選擇醫(yī)院作為臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。建議企業(yè)密切關(guān)注藥監(jiān)局的相關(guān)法規(guī)，按照要求選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。第三，臨床試驗(yàn)人群。該類(lèi)試劑的預(yù)期用途為結(jié)核病的輔助診斷。臨床試驗(yàn)的入選人群應(yīng)為其適用人群。根據(jù)其預(yù)期用途，臨床試驗(yàn)的入選人群應(yīng)為疑似結(jié)核病患者。臨床原始數(shù)據(jù)中，應(yīng)明確每例患者的年齡、性別和臨床診斷等信息，以判斷入選人群是否合理。建議包括一定數(shù)量的肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者，一定數(shù)量的涂片陰性和涂片陽(yáng)性的結(jié)核病患者，包括一部分易與結(jié)核病混淆的其他疾病患者。

在注冊(cè)審評(píng)過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)該類(lèi)試劑的臨床試驗(yàn)存在如下問(wèn)題：(1)臨床方案和報(bào)告前后不一致；(2)未嚴(yán)格按照對(duì)比試劑和申報(bào)產(chǎn)品的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)；(3)無(wú)故刪除試驗(yàn)患者；(4)入選患者選擇偏倚，如選擇大量健康人群作為特異度驗(yàn)證的適用人群，人為提高檢測(cè)特異度；(5)僅給出陰性符合率和陽(yáng)性符合率等，未進(jìn)行定性統(tǒng)計(jì)分析等。

綜上所述，結(jié)核病的診斷較為復(fù)雜，需要更多的好產(chǎn)品用于臨床輔助診斷，幫助臨床醫(yī)生做出正確的診斷。結(jié)核抗體檢測(cè)試劑在臨床上有其應(yīng)用價(jià)值，但是也存在一定的缺陷。正確看待上述結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用價(jià)值，努力提升其質(zhì)量，是醫(yī)療機(jī)構(gòu)、企業(yè)和監(jiān)管部門(mén)共同的責(zé)任。

[1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2017.Geneva: World Health Organization,2017.

[2] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[3] World Health Organization.World Health Organization(2011)policy statement: commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis.Geneva: World Health Organization,2011.

[4] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)核病血液檢測(cè)試劑監(jiān)管有關(guān)事宜的通知[EB/OL].(2012-04-16)[2017-11-20].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0845/71147.html.

[5] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于發(fā)布體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則的通告[EB/OL].(2014-09-11)[2017-11-20].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/106241.html.

DiscussionontheproblemsrelatedtoMycobacteriumtuberculosisantibodydetectionreagents

LIURong-zhi.

CenterforMedicalDeviceEvaluation,ChinaFoodandDrugAdministration,Beijing100081,China

LIURong-zhi,Email:liurz@cmde.org.cn

The role ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents in the diagnosis of tuberculosis has been involved in the related guidelines.The application ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents in clinic has been questioned by the World Health Organization (WHO).This paper analyzes the current status of the registration ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents in China and the possible reasons.Meanwhile,we expound the key issues of main raw materials,performance analysis and clinical trial in the registration and declaration ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents.

Mycobacteriumtuberculosis; Antibodies; Reagent kits,diagnostic; Clinical trial; Problem-based learning

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.006

100081 北京，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心

劉容枝，Email：liurz@cmde.org.cn

2017-11-21)

李敬文)