馮洋洋 徐興祥

肺癌是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-2]。特別是在中國(guó)，肺癌病死率每年達(dá)50萬以上，嚴(yán)重威脅公眾健康。其原因是大多數(shù)肺癌患者在無癥狀期時(shí)不易發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)癥狀時(shí)多已處于晚期，因此大多數(shù)肺癌患者在初診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肺癌預(yù)后差，生存率低[3]。盡管自1970年以來對(duì)肺癌進(jìn)行了大量研究，但肺癌的預(yù)后仍不樂觀，病死率仍未見明顯改善(五年生存率80%～85%)，其原因主要有兩個(gè)方面，首先是缺乏對(duì)早期肺癌有高靈敏度及特異度的診斷方法，其次是缺乏對(duì)進(jìn)展期肺癌的有效治療策略[4]。有關(guān)肺癌的篩查試驗(yàn)表明，肺癌的早期檢測(cè)能夠改善肺癌患者的長(zhǎng)期生存。超過50 000例患者應(yīng)用低劑量CT掃描或胸部X線進(jìn)行了篩選，CT掃描篩查的患者中，有24%的陽(yáng)性檢出率，使肺癌特異性病死率降低了20%，可見肺癌高危人群的早期診斷對(duì)其預(yù)后及生存具有重要意義。但在這24%的陽(yáng)性結(jié)果中有96%為假陽(yáng)性[5]。2017年NCCN最新版肺癌篩查指南對(duì)肺癌高危人群的定義為年齡在55～74歲之間，吸煙史大于30包/年且戒煙少于15年，或年齡>50歲，吸煙史大于20包年，存在除二手煙以外的上述危險(xiǎn)因素之一[6]。面對(duì)如此龐大的肺癌高危人群，肺癌的早期診斷至關(guān)重要。除了上述的低劑量CT已被廣泛應(yīng)用肺部的早期篩查，近年來miRNA對(duì)惡性腫瘤的早期診斷價(jià)值越來越受到重視， miRNA在包括肺癌在內(nèi)的腫瘤患者的血液、體液中顯著高表達(dá)?，F(xiàn)就近年MicroRNA在肺癌早期診斷中的研究進(jìn)展作一綜述。

一、MicroRNA及其生物學(xué)功能

MicroRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小單鏈RNA(19～24個(gè)核苷酸)，最初在線蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[7]。目前在人類體內(nèi)至少有1 000個(gè)基因位點(diǎn)編碼miRNAs。miRNAs作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，且與信使RNA的表達(dá)有關(guān)，此類分子能通過與目標(biāo)miRNAs3’端非翻譯區(qū)結(jié)合抑制基因的翻譯過程或降解信使RNA，一些miRNAs可能存在成千上萬的目標(biāo)mRNAs,生物學(xué)信息數(shù)據(jù)資料表明至少20%～30%人類基因的轉(zhuǎn)錄過程受到miRNAs的調(diào)節(jié)[8-10]。miRNAs除在腫瘤組織中能夠被檢測(cè)到，其在血漿、血清及尿液中也有表達(dá)。研究表明，miRNAs在血液中很容易被檢測(cè)到，主要通過三種不同的機(jī)制釋放入血，分別為裂解細(xì)胞被動(dòng)漏出、細(xì)胞微泡主動(dòng)釋放、以微泡形式主動(dòng)分泌[11-12]。另一種尚未明確的機(jī)制為外泌體內(nèi)的miRNAs的胞外釋放，外泌體是細(xì)胞內(nèi)與多囊泡體融合的小薄膜囊泡，能夠釋放進(jìn)入細(xì)胞外微環(huán)境[13]。研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞釋放更多的外泌體miRNAs[14]。此外，miRNAs在不同的生物標(biāo)本中有較高的穩(wěn)定性，主要是因?yàn)槠鋵?duì)內(nèi)外源性的RNA酶、極端溫度和pH、重復(fù)冰熔循環(huán)有較高的抵抗力[11-12, 15-16]。因此，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

二、MicroRNA在惡性腫瘤中的表達(dá)

研究表明，在許多種腫瘤中均檢測(cè)到miRNAs異常表達(dá)，miRNAs在腫瘤發(fā)生中扮演重要的角色[17]。Hayashita 等[18]發(fā)現(xiàn)miRNA17-92在肺癌中顯著上調(diào)，特別是在小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)更明顯。miRNA-21在乳腺癌、肺癌、胃癌及前列腺癌中呈過表達(dá)[19]。miRNAs可能是通過調(diào)控癌基因、抑癌基因的表達(dá)及改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路促進(jìn)肺腫瘤的發(fā)生，如Let-7家族可負(fù)調(diào)節(jié)RAS癌基因表達(dá)，而let-7在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中檢測(cè)到呈低表達(dá)[20]。miR-196a在肺癌組織中檢測(cè)到呈高表達(dá)，且主要是在肺上皮細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)途徑下游發(fā)揮作用，通過調(diào)節(jié)FoxO1、CDKN1B (hereafter p27) 和HOXA9的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及增殖[21]；另一實(shí)驗(yàn)證實(shí)MiR-18a-5p在NSCLC肺組織中顯著高表達(dá)，其通過抑制干擾素調(diào)節(jié)因子2(interferon regulatory factor 2, IRF2)的促凋亡、抑生增殖及轉(zhuǎn)移的作用促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[22]。miRNA-21通過抑制凋亡相關(guān)蛋白4抗體(programmed cell deanth 4, PDCD4)的表達(dá)及激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)途徑降低NSCLC患者的化療敏感性,使肺癌患者治療效果不佳[23]。值得注意的是，miRNAs也可能直接作為癌基因及抑癌基因在腫瘤的發(fā)生過程發(fā)揮作用， miRNA能夠直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路間接調(diào)控細(xì)胞的凋亡參與腫瘤的發(fā)生。let-7、miRNA15a與miRNA-16-1為腫瘤抑制基因，而miRNA-17-92、miRNA-155與miRNA-373被認(rèn)為是致癌基因。因此，腫瘤的發(fā)生與miRNAs的異常表達(dá)存在高度聯(lián)系。miRNAs在惡性腫瘤中的表達(dá)與其診斷、分期、進(jìn)展、預(yù)后、轉(zhuǎn)移及對(duì)治療的反應(yīng)有著密切的關(guān)系。

三、循環(huán)中miRNA

miRNAs在肺癌患者血液中異常表達(dá)，其靈敏度及特異度各有不同，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究檢測(cè)到的miRNA類型也缺乏一致性。研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ期的NSCLC患者血液中的六種miRNAs(miR-205, miR-200b, miR-125b, miR-34b, miR-429, miR-203)表達(dá)顯著升高，其中miR-200b具有最高的靈敏度及特異度。6種RNAs總的靈敏度及特異度為85%、74%，如從臨床角度考慮，進(jìn)一步降低閾值，其靈敏度及特異度會(huì)進(jìn)一步提高[24]。研究表明六種miRNAs(miR-103, miR-146a, miR-151-3p, miR-221,miR-222, miR-223)在肺腺癌(adenocarcinoma, ADC)患者中呈高表達(dá)。其中，miR-146a，miR-222和miR-223三者總的有效閾值、靈敏度、特異度分別為0.5015、84.35%、90.83%，在各預(yù)測(cè)模型中最高，其診斷ADC的準(zhǔn)確性為90.83%。與健康組相比以上三種miRNAs在Ⅰ、Ⅱ期肺癌中的AUC分別為 0.942、0.968，表明其在ADC患者早期診斷中有應(yīng)用價(jià)值[25]。一項(xiàng)對(duì)99例Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者血漿標(biāo)本的分析發(fā)現(xiàn)，六種miRNAs的表達(dá)較正常及良性疾病組顯著升高，其中miRNA30a上調(diào)最明顯，但在不同病理類型(腺癌、鱗癌、SCLC)中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與NSCLC的臨床特點(diǎn)也無明顯相關(guān)。實(shí)驗(yàn)顯示miRNA30a的AUC為0.727，診斷閾值為0.061，靈敏度及特異度為61.0%、84.3%.表明miRNA30a可作為肺癌早期診斷的有價(jià)值指標(biāo)[26]。另一項(xiàng)關(guān)于早期NSCLC診斷的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR145、miR20a、miR21、miR223在肺癌組中表達(dá)顯著升高，四者的 AUCs 介于0.809～0.889，最佳閾值在1.101～4.086，此閾值四者的靈敏度及特異度為89.2%～79.8%；85.5%～69.8%。四者聯(lián)合檢測(cè)有最高的NSCLC預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，AUC、分界值，靈敏度及特異度，分別為0.897，1.485，81.8%和90.1%。并且該實(shí)驗(yàn)證實(shí)術(shù)后肺癌患者血液中以上四種miRNA的表達(dá)較術(shù)前明顯降低[27]。2015年一項(xiàng)研究表明miRNA-125a-5p,miRNA-25及miRNA-126在早期肺癌血清中的靈敏度及特異度均為87.5%[28]。同年，另一研究證實(shí)miRNA-194, 652,和660聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度及特異度為85.9%、93.4%，并與一個(gè)研究組織合作證實(shí)miRNA-483-5p，193a-3p，214，25，7聯(lián)合檢測(cè)也具有較高的敏感性和特異性，為89%和68%[29-30]。miRNAs在肺惡性孤立性肺結(jié)節(jié)(solitary pulmonary nodule, SPNs)患者血漿中亦有表達(dá)，所測(cè)miRNA-21、210、486-5p、miRNA-126的靈敏度及特異度分別為76.3%、86.2%、85%和97%[31-32]。

上述研究檢測(cè)到多種miRNAs在肺癌患者血液中呈高表達(dá)，且多種miRNAs的聯(lián)合檢測(cè)較單一miRNA鑒別肺癌的靈敏度及特異度明顯提高。研究報(bào)道m(xù)iR145、miR20a、miR21、miR223四者單獨(dú)鑒別肺癌的靈敏度及特異度范圍分別為69.8%～80.6%、84.3%～89.2%，而四種聯(lián)合鑒別肺癌的靈敏度及特異度分別提高到了81.8%、90.1%[27]?？梢?，miRNA不僅可以作為肺癌早期診斷的有效標(biāo)志物，且多種miRNAs聯(lián)合檢測(cè)可提高其診斷準(zhǔn)確性。

四、痰液及肺泡灌洗液中miRNA

在肺癌的檢測(cè)中，痰液提供了miRNAs的有效來源，miRNAs存在于肺癌細(xì)胞中，并脫落進(jìn)入呼吸道最終以痰的形式咳出體外。一項(xiàng)單一痰標(biāo)本實(shí)驗(yàn)顯示miRNA21、143、155、210、372在早期NSCLC中的靈敏度及特異度為83.3%、100%。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA21、210、372在其中占主要地位，miRNA21、210、372在早期肺癌組(NSCLC Ⅱ期)中三者的靈敏度及特異度為67%、90%，陽(yáng)性、陰性預(yù)測(cè)值為93%、56%[33-34]。另一項(xiàng)小樣本量的可行性研究評(píng)估了miRNA-21在NSCLC與非癌性患者痰標(biāo)本中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)肺癌患者痰標(biāo)本中miRNA-21的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，其靈敏度為69.66%，特異度為100.00%[35]。與單一的miRNA測(cè)定相比，miR- 21, miR-486, miR-375和miR-200b的系列檢測(cè)在鑒別早期肺腺癌(Ⅰ期)中有最好的預(yù)測(cè)性，靈敏度及特異度為80.6%、91.7%[36]。研究發(fā)現(xiàn)miR-205診斷肺鱗癌的靈敏度及特異度為96%、90%，預(yù)示著其可能成為診斷肺鱗癌的高度精確標(biāo)志物[37]。相似的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-205, miR-210及miR-708三者序列檢測(cè)鑒別肺癌的靈敏度及特異度為73%、96%，與任意單一miRNA檢測(cè)比較，三者聯(lián)合檢測(cè)具有最好的預(yù)測(cè)性[38]。

雖然評(píng)估肺癌患者痰中的miRNAs的文獻(xiàn)較少，但是與血液相比較痰是一種很有潛力的生物樣本，因?yàn)樘禈?biāo)本的采集對(duì)患者來說是完全無創(chuàng)的，并且其分析也較簡(jiǎn)單。此外，miRNA在痰中的表達(dá)水平是非常穩(wěn)定的，痰標(biāo)本采集后第1天到第7天miRNA的表達(dá)水平不會(huì)發(fā)生改變，該特性使其可作為一個(gè)有潛力的生物樣品用于檢測(cè)miRNA[35]。 利用清晨痰標(biāo)本或單個(gè)患者重復(fù)多次采集標(biāo)本分析能夠顯著提高痰標(biāo)本的診斷率。

除血液和痰外，近年來肺泡灌洗液診斷肺癌的價(jià)值受到越來越多的關(guān)注，已有研究對(duì)肺泡灌洗液中腫瘤標(biāo)志物及蛋白標(biāo)志物進(jìn)行了報(bào)道，但對(duì)肺泡灌洗液中microRNA的研究很少，有研究顯示肺腺癌患者肺泡灌洗液外泌體中miRNA(miRNA-126)較對(duì)照組顯著高表達(dá)[39]。miRNA-10b在NSCLC患者肺泡灌洗液中顯著高表達(dá)，AUC值為0.931，且miRNA-10b高表達(dá)與肺癌的臨床分期有高度的一致性，預(yù)示miRNA-10b可作為NSCLC篩查的可靠標(biāo)志物[40]。但肺泡灌洗液需在支氣管鏡下沖洗氣道后回收灌洗液獲得，費(fèi)用較高且患者的依從性差，因此其較血液及痰更難獲得。

當(dāng)前CT篩查肺部結(jié)節(jié)已得到廣泛應(yīng)用，因此miRNAs與CT相結(jié)合進(jìn)行肺癌篩查與診斷將是一項(xiàng)有意義的研究，研究顯示，miRNA-126，139和429在肺癌人群與對(duì)照組相比，敏感性和特異性分別為72%和95%[38]。有研究利用同一群體評(píng)估m(xù)iRNA-31和210序列區(qū)分健康對(duì)照組與ADC或SCC患者的能力，該研究還對(duì)CT聯(lián)合miRNAs序列檢測(cè)鑒別肺癌的能力進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果證實(shí)，CT聯(lián)合miRNA序列檢測(cè)表現(xiàn)出了更高的特異性(91.2%、 83.8%)和相近的敏感性(92.4%、93.9%)。可見，miRNA聯(lián)合CT能夠顯著提高肺癌的診斷率。

理想的腫瘤標(biāo)志物其特異度、靈敏度應(yīng)與腫瘤負(fù)荷成正比，早期的大量文獻(xiàn)已表明循環(huán)miRNAs可滿足此標(biāo)準(zhǔn)。自從在肺癌患者血液中檢測(cè)到miRNA，大量研究致力于檢測(cè)可用于肺癌篩查、診斷及預(yù)后判斷的關(guān)鍵miRNAs。盡管此領(lǐng)域有巨大的發(fā)展?jié)摿Γh(huán)miRNAs作為肺癌檢測(cè)的生物標(biāo)志物仍需大量研究以證實(shí)。其一，建立簡(jiǎn)易標(biāo)準(zhǔn)的分析法對(duì)各種體液中的miRNAs進(jìn)行定量分析，對(duì)循環(huán)miRNAs的特異度及靈敏度尚需要大樣本實(shí)驗(yàn)予以評(píng)估。其次，特定的腫瘤相關(guān)循環(huán)miRNAs應(yīng)被開發(fā)為肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物，其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制也應(yīng)予以明確。最后，隨著循環(huán)miRNAs檢測(cè)與分析方法的不斷進(jìn)步，檢測(cè)工具也必須具備反映檢測(cè)與分析兩方面的能力。特定循環(huán)miRNAs的廣泛適應(yīng)性與潛在重要性有利于開發(fā)為可重復(fù)、可靠地生物標(biāo)志物，并應(yīng)用于肺癌的檢測(cè)、診斷與預(yù)后判斷。