張倩 馮喜英 久太

一、肺結(jié)核的流行病學(xué)

肺結(jié)核病(tuberculosis)是通過(guò)呼吸道傳播的疾病，對(duì)人類(lèi)健康及國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失[1]，2015年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，全球約有960萬(wàn)新的肺結(jié)核病例[2]，中國(guó)仍是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，占全球總負(fù)擔(dān)的 15%[3-6]。肺結(jié)核主要好發(fā)于青壯年，而這部分人群是社會(huì)和家庭財(cái)富的主要?jiǎng)?chuàng)造者，青壯年患肺結(jié)核更容易導(dǎo)致家庭因病返貧、因病致貧，而且對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及其不利[7]，但至今為止尚仍沒(méi)有特異性適用于所有類(lèi)型肺結(jié)核的快速診斷檢測(cè)方法。尋找快速準(zhǔn)確的診斷方法仍是目前結(jié)核病診療的首要任務(wù)，同時(shí)也是防治結(jié)核病的重要環(huán)節(jié)[8-9]。

二、肺結(jié)核相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制

當(dāng)人體通過(guò)呼吸道感染結(jié)核分枝桿菌后，其大多數(shù)并不發(fā)病，其主要原因是人體的保護(hù)機(jī)制，發(fā)揮主要作用的是細(xì)胞免疫。T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起重要作用，巨噬細(xì)胞是主要的起始和效應(yīng)細(xì)胞。T細(xì)胞可產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)劑，如干擾素γ(interferon gamma, IFN-γ) 、白細(xì)胞介素 (interleukin, IL) 12和淋巴毒素α。外周T細(xì)胞通過(guò)識(shí)別結(jié)核菌抗原刺激IFN-γ和腫瘤壞死因子α的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮作用[10]；當(dāng)感染結(jié)核桿菌，自身的免疫系統(tǒng)將會(huì)開(kāi)啟，釋放出巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌，可以使結(jié)核桿菌喪失其生存環(huán)境, 降低結(jié)核桿菌的活性，之后受感染的細(xì)胞及巨噬細(xì)胞進(jìn)行自主凋亡過(guò)程, 清除機(jī)體受損[11]。然而，研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在抗結(jié)核中有重要的保護(hù)作用[12]。位于淋巴器官生發(fā)中心的B細(xì)胞通過(guò)很多方式發(fā)揮作用[13]：①它可以充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞并影響T細(xì)胞的活化，從而在抗感染的防御中發(fā)揮作用;②可通過(guò)產(chǎn)生影響T輔助細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞因子在抗感染的防御中發(fā)揮作用；③B細(xì)胞可產(chǎn)生抗體，抗體通過(guò)調(diào)理作用、補(bǔ)體激活以及增強(qiáng)FcR介導(dǎo)的Mtb吞噬作用和殺傷作用來(lái)影響肺泡腔內(nèi)感染，抗體并通過(guò)形成免疫復(fù)合物來(lái)清除免疫調(diào)節(jié)性Mtb抗原。綜上所述，B細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)發(fā)揮作用。

三、miRNA概述

miRNA既為微小RNA，是近年來(lái)在許多真核細(xì)胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的源自?xún)?nèi)源性染色體的非編碼單鏈調(diào)控RNA。miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫機(jī)制中起著重要作用[14]，miRNA 可以調(diào)控許多生物學(xué)的過(guò)程，如細(xì)菌感染、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、細(xì)胞代謝、器官分化、信號(hào)通路等和多個(gè)生理和病理過(guò)程。近年來(lái)隨著對(duì)miRNA研究深入，結(jié)核病患者體內(nèi)一些特異表達(dá)的miRNA越來(lái)越得到重視[15]。鑒于血清miRNAs具有檢測(cè)手段較簡(jiǎn)便、易于收集、保存時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，且具備作為疾病分子生物標(biāo)志物的優(yōu)點(diǎn)，它很可能在肺結(jié)核的診斷和預(yù)后方面具有潛在的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

1. miR-155: miR-155是目前公認(rèn)的參與眾多生物過(guò)程的miRNA，例如感染、炎癥和免疫等[15]。研究表明結(jié)核分枝桿菌感染后miR-155的表達(dá)明顯升高，可作為肺結(jié)核診斷的潛在標(biāo)志物[16]。研究表明在結(jié)核分枝桿菌感染后會(huì)引起細(xì)胞的自噬作用。自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，細(xì)胞主要是通過(guò)自噬和溶酶體消除、降解和消化受損、變性、衰老成為失去功能的變性蛋白質(zhì)、細(xì)胞器及其核酸等生物大分子。然而，自噬過(guò)多或過(guò)少均反過(guò)來(lái)危害細(xì)胞本身，自噬作用與自噬蛋白呈正相關(guān)(ATG1-ATG5)。研究發(fā)現(xiàn)，在被結(jié)核分枝桿菌感染的樹(shù)突狀細(xì)胞中，結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)miRNA-155下調(diào)ATG3， 下調(diào)的miR-155與ATG3 mRNA的3′UTR區(qū)域相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平降低，這將導(dǎo)致包漿型LC3(LC3I)轉(zhuǎn)化為自噬型LC3(LC3-Ⅱ)，導(dǎo)致自噬[17]。綜上miRNA-155在結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。

2. miR-144: 呂艷等[18]通過(guò)對(duì)比肺結(jié)核治療前后miR-144的變化水平，提示在活動(dòng)性肺結(jié)核中miR-144呈現(xiàn)高表達(dá)，在治療好轉(zhuǎn)后miR-144呈下降趨勢(shì)。張立營(yíng)等[19]通過(guò)研究活動(dòng)期肺結(jié)核外周血中miR-144的表達(dá)水平與其血漿中的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)外周血miR-144的表達(dá)水平與IL-6、TNF-α、IFN-γ的濃度呈負(fù)相關(guān)，這與Liu等[20]提出的觀點(diǎn)不謀而合。Liu等[20]研究提出miR-144可以抑制TNF-α和IFN-γ的產(chǎn)生，由于TNF-α和IFN-γ在保護(hù)性免疫中具有重要作用，因此提示miR-144 可能通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(TNF-α和IFN-γ)來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌的免疫過(guò)程。此外他們還提出miR-144可通過(guò)作用于轉(zhuǎn)錄激活因子(Jak-STAT)信號(hào)傳導(dǎo)、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)等傳導(dǎo)途徑的基因而發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。因此miR-144的表達(dá)水平極有可能影響結(jié)核病的發(fā)展和結(jié)局。

3. miR-29: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)均表明在感染結(jié)核分枝桿菌后miR-29明顯升高[21-22]，miR-29主要通過(guò)下調(diào)IFN-γ來(lái)減弱機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答。除靶向調(diào)控3'UTR IFN-γmRNA外，miR-29還可以促進(jìn)IFN-γmRNA與Argonaute 2(Ago2)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，從而在轉(zhuǎn)錄中抑制IFN-γ的表達(dá)[23]。此外，研究表明，miR-29也可以靶向調(diào)節(jié)抗凋亡的p85α激酶和B細(xì)胞淋巴瘤2基因(Bcl-2)蛋白、GTPβ結(jié)合蛋白Cdc42以及髓樣細(xì)胞白血病-1基因(Mcl-1)蛋白[24-25]，這表明 miR-29在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的凋亡途徑中起著關(guān)鍵的作用。 因此，結(jié)核分枝桿菌感染中miR-29的高表達(dá)可部分解釋結(jié)核分枝桿菌通過(guò)抑制IFN-γ和增加細(xì)胞凋亡以避免巨噬細(xì)胞吞噬的作用機(jī)制。有趣的是，在非致病的分枝桿菌感染模型中，miR-29表達(dá)下調(diào)。在NK細(xì)胞和T細(xì)胞中，牛分枝桿菌卡介苗可下調(diào)miR-29表達(dá)并誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)[26]。 綜上所述，miR-29表達(dá)升高可能抑制了T細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生，并且miR-29的表達(dá)受到分枝桿菌菌種特異性毒力的影響。

4. miR-let-7: 早期研究表明，miR-let-7家族在機(jī)體對(duì)病原體的免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Kumar等[27]的研究結(jié)果顯示：結(jié)核分枝桿菌感染可顯著降低巨噬細(xì)胞中miR-let-7 的表達(dá)水平，而miR-let-7 的下調(diào)表達(dá)與結(jié)核分枝桿菌分泌的ESAT-6蛋白密切相關(guān)。A20(鋅脂蛋白A20基因)作為 miR-let-7的靶基因，是NF-κB通路的一種拮抗劑，結(jié)核分枝桿菌染后，巨噬細(xì)胞中miR-let-7的低表達(dá)上調(diào)了A20基因的表達(dá)，從而減弱NF-κB通路的活性。另外，該研究還指出，在缺乏A20的巨噬細(xì)胞中，結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)速度減慢，而TNF、IL-1、亞硝酸鹽等細(xì)胞因子的合成是增強(qiáng)的；換言之，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-let-7的高表達(dá)會(huì)減弱結(jié)核分枝桿菌的生存力，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞因子TNF、IL-1及亞硝酸鹽的合成。綜上所述，miR-let-7通過(guò)特異性靶向抑制A20基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)NF-κB通路的活性，產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡并控制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)和繁殖速率。

5. miR-223: Dorhoi等[28]的研究表明，結(jié)核病患者的單核細(xì)胞中miR-223水平明顯上調(diào)，并指出 miR-223可以負(fù)向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。miR-223可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制抑制中性粒細(xì)胞趨化因子如CXC趨化因子配體2(CXCL2)、趨化因子配體8(CXCL8)、CC趨化因子配體3(CCL3)和白細(xì)胞介素6等的表達(dá)，從而阻止大量中性粒細(xì)胞趨化至肺組織而導(dǎo)致的病理?yè)p傷，發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。Cliff等[29]的研究表明miRNA-223的缺失導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少并隨后加劇肺部炎癥，特別是在肺結(jié)核病理學(xué)過(guò)程中格外顯著，這也印證了miRNA-223的表達(dá)上調(diào)對(duì)肺結(jié)核感染時(shí)發(fā)揮的保護(hù)作用。Liu等[30]的研究提示：miR-223通過(guò)抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞中的p65磷酸化和核移位來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB的活化，從而抑制體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)，并進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，從而抑制機(jī)體的抗結(jié)核免疫。綜上所述，肺結(jié)核感染中miR-223表達(dá)的上調(diào)在機(jī)體免疫中起著重要的保護(hù)作用。

6. miR-21: 相關(guān)研究表明：miR-21抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)并促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生[31]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在被牛分枝桿菌感染后，無(wú)論在體外或體內(nèi)，在未致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均可通過(guò)TLR / Erk / NF-κB途徑上調(diào)miR-21的表達(dá)[32]。miR-21在早期結(jié)核分枝桿菌分泌的抗原性靶蛋白(相對(duì)分子量為6×103)抗原攻擊巨噬細(xì)胞后表達(dá)呈上調(diào)，在抗原呈遞細(xì)胞中降低miR-21活性，顯著促進(jìn)機(jī)體抗分枝桿菌免疫的作用。miR-21還可通過(guò)直接靶向3′UTR IL-12 mRNA來(lái)抑制IL-12的表達(dá)，從而抑制宿主Th1的應(yīng)答。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-21在抑制結(jié)核分枝桿菌感染中，具有保護(hù)性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6基因的表達(dá)，但是這些細(xì)胞因子水平在ESAT-6暴露后并沒(méi)有顯著改變。有趣的是，miR-21也通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Bcl-2促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞凋亡，這也證實(shí)了以前的發(fā)現(xiàn)：既結(jié)核分枝桿菌可誘導(dǎo)被感染細(xì)胞凋亡，但miR-21可調(diào)控Bcl-2表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。另外，miR-21通過(guò)誘導(dǎo)抑制IL-12的產(chǎn)生觸發(fā)更有效的抗分支桿菌應(yīng)答。因此，miR-21可能是分枝桿菌可用于逃避宿主免疫應(yīng)答并建立慢性感染的有效機(jī)制。

隨著研究的深入，大量科學(xué)證據(jù)表明miRNA參與結(jié)核病感染的進(jìn)程，并在基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制中起著重要作用。 此外，研究發(fā)現(xiàn)血液，痰液和胸腔積液的特定miRNAs在區(qū)分結(jié)核感染和健康個(gè)體、活動(dòng)性和潛伏性結(jié)核感染、結(jié)核和其他感染以及肺部疾病方面有重要意義，并且miRNAs具有易收集、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，故miRNAs可作為結(jié)核桿菌感染的潛在診斷依據(jù)，以及作為評(píng)估結(jié)核病治療進(jìn)程中的生物標(biāo)志物。但目前miRNA的研究分析尚未覆蓋少數(shù)民族及不同海拔高度的人群。相信隨著對(duì) miRNA 研究的不斷深入，對(duì)少數(shù)民族及不同海拔高度人群結(jié)核相關(guān)的miRNA發(fā)現(xiàn)；將會(huì)提出關(guān)于肺結(jié)核的更準(zhǔn)確、更有臨床價(jià)值的特異性的miRNAs，并為結(jié)核病診斷與治療提供新的思路與策略，推動(dòng)結(jié)核病診斷與治療的發(fā)展。