鄭妍 劉舒 宋鳳瑞 劉志強(qiáng)

摘 要 利用β-淀粉樣蛋白片段Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，從細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激兩個(gè)通路研究定志小丸對(duì)Aβ25-35引起的PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并將定志小丸拆方為單味藥及三味藥， 用以闡明定志小丸治療阿爾茲海默病的作用機(jī)制、配伍機(jī)制以及主要活性藥味。通過(guò)MTT和乳酸脫氫酶含量測(cè)定評(píng)估定志小丸及各味藥對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響，其中人參、茯苓效果最好，與模型組相比，可使細(xì)胞活力提高約30%。通過(guò)細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位（MMP）、丙二醛（MDA）及還原型谷胱甘肽（GSH）含量測(cè)定，進(jìn)一步從細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激兩個(gè)通路研究定志小丸及各味藥對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞保護(hù)作用，研究結(jié)果表明，人參、茯苓效果最優(yōu)，不僅可以顯著抑制細(xì)胞凋亡，還可降低丙二醛（MDA）含量，減少膜脂過(guò)氧化； 遠(yuǎn)志、石菖蒲可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激損傷，且與人參、茯苓配伍后，可促進(jìn)主要成分發(fā)揮藥效，顯著提高人參、茯苓的藥效。人參、茯苓是定志小丸中的主要活性藥味，遠(yuǎn)志、石菖蒲起輔助增強(qiáng)藥效的作用。

關(guān)鍵詞 定志小丸； 拆方； 配伍作用； Aβ25-35； PC12細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 氧化應(yīng)激

1 引 言

阿爾茨海默病（AD）是一種以認(rèn)知能力喪失為特征的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變以及語(yǔ)言障礙。由于缺乏有效的治療藥物，使得AD對(duì)患者及其家人都是一種毀滅性的疾病[1]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑后，誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷甚至死亡，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能進(jìn)行性退化，是目前公認(rèn)的主要發(fā)病機(jī)制之一[2，3]。因此，大量研究致力于篩選抗氧化劑和抗凋亡藥物作為潛在的AD治療藥物[4～9]。

中藥復(fù)方雖然成分復(fù)雜，但可以通過(guò)多成分作用于疾病相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)而發(fā)揮協(xié)同治療作用，效果好且副作用較少，這與現(xiàn)代藥物集中單一靶點(diǎn)治療疾病不同。越來(lái)越多的學(xué)者致力于研究中藥對(duì)于AD的預(yù)防以及治療作用[4，10～15]。定志小丸（DZXW），源于唐代孫思邈的《備急千金要方》，由人參（GR）、茯苓（P）、遠(yuǎn)志（PR）和石菖蒲（ATR）四味藥按照質(zhì)量比3∶3∶2∶2 的比例組成，人參為“君藥”，茯苓為“臣藥”，遠(yuǎn)志和石菖蒲為“佐藥”，已在臨床上應(yīng)用多年，主要用于治療抑郁癥、焦慮癥、神經(jīng)衰弱、阿爾茨海默病及帕金森病等病癥[16～18]。之前的研究已經(jīng)確定了定志小丸中的64種主要活性成分，包括人參皂苷、三萜類化合物、遠(yuǎn)志皂苷、寡糖酯、蔗糖酯、山酮糖苷等[19]。在藥理學(xué)研究方面，目前大部分研究都集中于人參、遠(yuǎn)志單味藥或某一種有效成分對(duì)于AD的治療作用[20～23]，定志小丸的作用機(jī)制及配伍機(jī)制尚不明確[24]。為了評(píng)價(jià)藥物對(duì)AD的潛在治療效果，目前已建立了多種細(xì)胞模型用以研究藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，常用細(xì)胞模型有研究腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用所使用的轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞系[10，25～27]，以及研究Aβ蛋白沉積導(dǎo)致細(xì)胞毒性和神經(jīng)元損傷所使用的Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型[3，15，20，21，28，29]，其中Aβ誘導(dǎo)的PC12損傷模型是目前應(yīng)用最為廣泛的AD治療藥物體外活性評(píng)價(jià)模型。Aβ聚集后可以通過(guò)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制造成AD患者神經(jīng)元大量丟失和突觸損傷[30]，在AD的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用。大量研究通過(guò)考察PC12細(xì)胞在Aβ蛋白介導(dǎo)下的氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡通路的變化考察藥物對(duì)AD的治療效果，如通過(guò)加入花青素可以顯著提高PC12細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力[7]，加入淫羊藿素后可以抑制細(xì)胞凋亡、減少LDH泄露及線粒體膜電位的降低[31]。

本研究使用Aβ蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型研究定志小丸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，選擇Aβ蛋白中毒性最強(qiáng)的Aβ25-35活性片段[32]。考察了定志小丸在細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激兩種機(jī)制下對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，其中細(xì)胞凋亡通路主要通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、LDH漏出量測(cè)定、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡（ANNEXIN V-FITC/PI雙染色法及線粒體膜電位）等方面進(jìn)行檢測(cè)； 氧化應(yīng)激通路主要檢測(cè)與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的抗氧化劑還原型谷胱甘肽（GSH）及膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量變化。為了闡明定志小丸的作用機(jī)制、配伍機(jī)制及主要活性藥味，除定志小丸外，還將其拆方成單味藥GR、P、PR、ATR及三味藥GR+P+PR、GR+P+ATR、GR+PR+ATR、P+PR+ATR，通過(guò)比較在細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激通路上對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用的差異，闡明定志小丸配伍的科學(xué)合理性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

BDAccuri C6流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）； Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Milford公司）； AL104 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； MCO175型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）； SpectraMax i3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）； Allegra X-30R型離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）。

茯苓、遠(yuǎn)志、石菖蒲均購(gòu)自河北凱達(dá)公司； 人參購(gòu)自吉林撫松； 所有中草藥均由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院黃青教授鑒定。Aβ25-35（Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)A4559，Mw=1060.26，白色固體粉末）； DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone公司）； 胎牛血清（BI公司）； 噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司）； 大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）?？捡R斯亮藍(lán)（50T）、丙二醛試劑盒（50T）、乳酸脫氫酶試劑盒（96T）和還原型谷胱甘肽試劑盒（96T）均購(gòu)自南京建成公司； ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（50T，Solarbio公司）； 羅丹明123（1 mg/mL，北京鼎國(guó)公司）。

2.2 中藥提取物制備

提取方法參考文獻(xiàn)[33]，取50 g的定志小丸用75%乙醇回流提取2次，每次提取時(shí)間為2 h，提取液為生藥量的8倍。合并兩次提取液，過(guò)濾、減壓濃縮至50 mL，得到定志小丸質(zhì)量濃度即生藥量為1 g/mL 的提取液。拆方后的單藥和三味藥的提取方法與定志小丸提取方法相同。

2.3 Aβ25-35老化處理

參照文獻(xiàn)[34]的方法，將Aβ25-35用高壓滅菌PBS（KH2PO4-NaHPO4，10 mmol/L， pH=7.2）緩沖鹽溶液配制成濃度為1 mmol/L的溶液， 37℃孵育72 h，使用時(shí)用高壓滅菌PBS緩沖鹽溶液稀釋為20 μmol/L[35]。

2.4 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%（V/V）胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并加入1% 青霉素-鏈霉素溶液。在含有5% CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，2～3天傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)分4組： 空白組、對(duì)照組、Aβ25-35模型組及Aβ25-35和中藥提取液共同作用組。將PC12細(xì)胞以4 × 103 /孔的密度種于96孔板上，培養(yǎng)24 h后，共同作用組將培養(yǎng)基替換為100 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基溶解的不同濃度的中藥提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其它3組更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后加入Aβ25-35誘導(dǎo)損傷24 h，其中對(duì)照組只更換培養(yǎng)液， 不加入Aβ25-35。棄去培養(yǎng)液，加入100 μL 1 mg/mL MTT孵育4 h后，去除MTT溶液， 并加入150 μL DMSO振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率（Survival rate， SR）。

2.5 ANNEXIN V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡

PC12細(xì)胞接種于6孔板，使用藥物及Aβ25-35干預(yù)后，收集各組細(xì)胞，使用冰PBS清洗兩次。使用試劑盒內(nèi)緩沖鹽懸浮細(xì)胞，300×g離心10 min，再用緩沖鹽重懸細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至1×106 個(gè)/mL。每管加入100 μL細(xì)胞及5 μL Annexin V-FITC，室溫下避光混勻10 min后，再加入5 μL PI室溫避光孵育5 min。 加入PBS至500 μL，輕輕搖勻，孔徑75 μm （200目）尼龍網(wǎng)過(guò)濾，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)： FITC： 激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm； PI： 激發(fā)波長(zhǎng)535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)615 nm。

2.6 線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)

將PC12細(xì)胞接種于6孔板，使用藥物及Aβ25-35干預(yù)后，收集各組細(xì)胞（約1×106個(gè)/mL），使用預(yù)熱的PBS緩沖液洗滌兩次，將羅丹明123加入至細(xì)胞懸液。37℃下孵育30 min，粒徑75 μm（200目）尼龍網(wǎng)過(guò)濾后， 使用流式細(xì)胞儀分析，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

2.7 乳酸脫氫酶（LDH）含量測(cè)定

使用LDH測(cè)定試劑盒，通過(guò)受損細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH定量測(cè)定PC12細(xì)胞的損傷。經(jīng)藥物和Aβ25-35處理后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒測(cè)定方法處理樣品，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度值，使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，高速離心后， 使用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度。

2.8 還原型谷胱甘肽（GSH）含量測(cè)定

將細(xì)胞接種于96孔板，使用藥物及Aβ25-35干預(yù)后，用冰PBS清洗2次，使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，高速離心后， 使用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，GSH含量用試劑盒測(cè)定。

2.9 丙二醛（MDA）含量測(cè)定

將PC12細(xì)胞接種于6孔板，干預(yù)結(jié)束后使用冰PBS清洗2次，使用RIPA裂解細(xì)胞，離心取上清液，先進(jìn)行蛋白定量分析，使用MDA試劑盒測(cè)定MDA含量。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)（x）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 定志小丸、拆方后單藥、三味藥及Aβ25-35對(duì)PC12的細(xì)胞毒性

由表1可知，生藥量為1 mg/mL的9種中藥提取物作用于PC12細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力與對(duì)照組并沒(méi)有顯著性差異，在此濃度下，藥物對(duì)于細(xì)胞并無(wú)毒性，因此選取1 mg/mL生藥量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的加藥濃度。

3.2 定志小丸及拆方后單藥、三味藥對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性的抑制作用

圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的活力明顯下降，說(shuō)明20 μmol/L Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞有明顯的毒性，加入1 mg/mL的不同中藥提取物后，PC12細(xì)胞活力顯著增加，其中人參、茯苓效果最為明顯。

3.3 定志小丸及拆方后的各味藥對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC可與磷脂酰絲氨酸（Phasphatidylserine，PS）特異性結(jié)合。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜失去對(duì)稱性，PS暴露于細(xì)胞膜外，可被Annexin V-FITC結(jié)合， 從而成為識(shí)別細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。但是壞死細(xì)胞的PS同樣外路露于細(xì)胞膜外，因此加入碘化吡啶（PI）以區(qū)分壞死細(xì)胞。凋亡早期細(xì)胞膜仍保持完整性，PI不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而處于凋亡晚期和壞死的細(xì)胞可同時(shí)被Annexin V-FITC/PI著色，可以準(zhǔn)確反映凋亡過(guò)程。流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞在培養(yǎng)或處理過(guò)程中有自發(fā)凋亡的現(xiàn)象，但凋亡率較低（圖2A），經(jīng)20 μmol/L Aβ25-35處理24 h后，凋亡細(xì)胞顯著增加，凋亡率達(dá)到71.4%（圖2B）。經(jīng)單味藥人參、茯苓（圖2C、D）處理后，細(xì)胞凋亡率顯著降低，說(shuō)明這兩味藥在抑制Aβ25-35損傷時(shí)起主要作用。

3.4 ANNEXIN V-FITC/PI法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

采用ANNEXIN V-FITC/PI雙染色法研究細(xì)胞凋亡變化和細(xì)胞損傷。該方法可將早、中、晚期及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。正常的活細(xì)胞，ANNEXIN V-FITC和PI均為低染，不著色； 細(xì)胞凋亡早期，ANNEXIN V-FITC高染， 細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，PI低染，細(xì)胞核不著色； 細(xì)胞凋亡中、晚期，ANNEXIN V-FITC和PI均高染，細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光[36]。如圖3所示，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，對(duì)照組（圖3A）所選區(qū)域無(wú)明顯細(xì)胞異常且無(wú)凋亡細(xì)胞，模型組（圖3B）中PC12細(xì)胞顯示出核聚集，細(xì)胞突起回縮，PI染色發(fā)出紅色熒光。經(jīng)定志小丸提取物處理后的細(xì)胞（圖3C-3K）其細(xì)胞凋亡發(fā)生了顯著的改善。其中，經(jīng)人參、茯苓和定志小丸處理過(guò)的細(xì)胞變化尤為明顯，無(wú)凋亡晚期細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)與健康細(xì)胞并無(wú)明顯差異。

3.5 定志小丸及各味藥抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體膜電位的下降

線粒體膜電位（MMP）在啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中起關(guān)鍵作用。MMP降低是細(xì)胞凋亡早期的重要特征之一[37]。如圖4A所示，與對(duì)照組相比，加入Aβ25-35作用24 h后，MMP顯著降低，PC12細(xì)胞經(jīng)中藥提取物處理后再加入20 μmol/L Aβ25-35作用24 h，MMP均有顯著升高。說(shuō)明定志小丸及拆方后的各味藥均能抑制Aβ25-35帶來(lái)的MMP降低，其中人參、茯苓單味藥效果最為顯著。

3.6 定志小丸及各味藥對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中LDH釋放的影響

當(dāng)PC12細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，細(xì)胞處于易損狀態(tài)，LDH漏出率會(huì)明顯增加[38]。LDH水平越高，說(shuō)明其細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。如圖4B所示，模型組LDH漏出率高出對(duì)照組70%，經(jīng)定志小丸及拆方后各味藥保護(hù)后，均可以顯著抑制LDH漏出，其中人參、茯苓單味藥效果最好，抑制漏出率可達(dá)40%以上。

3.7 定志小丸及各味藥對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，其含量高低可以作為考察細(xì)胞受損程度的指標(biāo)之一，MDA的主要危害是導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行[39]。如圖4C所示，模型組與對(duì)照組相比，MDA含量顯著升高，說(shuō)明Aβ25-35可以造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，經(jīng)定志小丸及拆方后各味藥保護(hù)后，MDA含量有不同程度降低，其中人參、茯苓單味藥效果最好。

3.8 定志小丸及各味藥對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞GSH含量的影響

GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的非蛋白巰基化合物，是細(xì)胞中含量很高的一種抗氧化劑，其含量的微小變化就可以影響細(xì)胞的氧化還原平衡，因此在保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激方面具有重要的作用[40，41]。經(jīng)定志小丸提取物作用后的PC12細(xì)胞中GSH含量均顯著性增加，其中遠(yuǎn)志、石菖蒲單藥作用效果最好（圖4D）。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，從細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激兩個(gè)角度對(duì)定志小丸治療AD的作用機(jī)制及配伍機(jī)制進(jìn)行了研究。通過(guò)比較定志小丸及其對(duì)應(yīng)的單味藥及三味藥在細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激通路上對(duì)PC12細(xì)胞保護(hù)作用的差異，闡明了定志小丸配伍的科學(xué)合理性： 人參、茯苓在維持細(xì)胞活力方面發(fā)揮主要作用，同時(shí)可以顯著降低MDA含量，減少氧化應(yīng)激損傷，是定志小丸中的主要活性藥味； 遠(yuǎn)志、石菖蒲可促進(jìn)GSH增加，主要通過(guò)中藥配伍后的協(xié)同作用促進(jìn)人參與茯苓兩味藥的治療效果。本研究結(jié)果表明，Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，是一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)周期短的細(xì)胞模型，不僅可以用于評(píng)價(jià)藥物治療AD的療效和研究其作用機(jī)制，并且還可以用于闡釋復(fù)方中藥的配伍機(jī)制。

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