王曉宇 陳嘯飛 顧妍秋 曹巖 原永芳 洪戰(zhàn)英 柴逸峰

摘 要 細(xì)胞膜色譜法作為近年來發(fā)展迅速的生物色譜技術(shù)，已成為篩選中藥復(fù)雜體系中活性成分和研究藥物與受體相互作用的重要工具。本文綜述了細(xì)胞膜色譜技術(shù)的發(fā)展、分離原理、制備方法、針對其穩(wěn)定性和壽命等問題進(jìn)行的制備方法學(xué)優(yōu)化、多種二維色譜方法學(xué)和應(yīng)用策略，以及在中藥等復(fù)雜體系活性成分篩選中的應(yīng)用情況。在此基礎(chǔ)上， 本文展望了細(xì)胞膜色譜技術(shù)未來的發(fā)展趨勢，以期為細(xì)胞膜色譜技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及在藥物高通量篩選領(lǐng)域的拓展應(yīng)用提供思路。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞膜色譜法； 共價(jià)制備策略； 全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)； 中藥活性成分篩選； 評述

1 引 言

細(xì)胞膜色譜（Cell membrane chromatography， CMC）是近年發(fā)展迅速的一種生物親和色譜技術(shù)，以細(xì)胞膜與色譜載體作為固定相，采用色譜分析法，可在體外模擬藥物分子與細(xì)胞膜受體的相互作用過程。細(xì)胞膜色譜法將復(fù)雜成分分離與化合物活性篩選結(jié)合，具有操作方便、快速穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于中藥等復(fù)雜體系的活性成分篩選。該技術(shù)自發(fā)明以來，經(jīng)過方法學(xué)的不斷改進(jìn)與完善，發(fā)展了近30種細(xì)胞膜色譜模型，成功應(yīng)用于40余種中藥或復(fù)方的活性成分篩選，同時(shí)應(yīng)用于研究藥物-受體相互作用[1]。本文對細(xì)胞膜色譜技術(shù)的研究進(jìn)展及其在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)綜述。

2 細(xì)胞膜色譜法的原理

細(xì)胞膜色譜法由西安交通大學(xué)賀浪沖教授課題組于1996年首次報(bào)道[2]，是一種以具有活性的細(xì)胞膜受體為固定相的仿生親合色譜技術(shù)，此技術(shù)利用細(xì)胞膜自身的融合作用和硅膠表面硅羥基（Si-OH）的吸附作用制備成細(xì)胞膜色譜固定相（Cell membrane stationary phase， CMSP），最大限度地保持了細(xì)胞膜的完整性、膜受體的空間結(jié)構(gòu)以及生物活性[3]。細(xì)胞膜色譜固定相示意圖如圖1A所示，中心紅色球體代表硅膠，周圍橙色代表細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，藍(lán)色代表細(xì)胞膜上的蛋白或受體，細(xì)胞膜和硅膠載體之間以氫鍵吸附作用結(jié)合，鍵合細(xì)胞膜后的硅膠載體掃描電鏡圖像如圖1B[3]所示。以 K+， Na+-三磷酸腺苷（K+， Na+-ATP）酶作為活性指標(biāo)，測定結(jié)合硅膠后的細(xì)胞膜、混懸液狀細(xì)胞膜和沉淀狀細(xì)胞膜，這三者之間酶活性無差異，可見硅膠可作為細(xì)胞膜的理想載體[4]； 細(xì)胞膜色譜固定相具有色譜分離和活性表征的雙重功能，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜體系藥物活性成分的篩選分析以及藥物與膜受體相互作用分析。

3 細(xì)胞膜色譜法方法學(xué)研究進(jìn)展

細(xì)胞膜色譜技術(shù)自建立以來得到了廣泛應(yīng)用，但仍然存在一些問題有待解決。首先，柱壽命短，其主要原因在于附著在硅膠上的細(xì)胞膜蛋白容易脫落或失去活性，影響了篩選結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。其次，對細(xì)胞膜色譜柱的制備質(zhì)量缺乏一個(gè)較為統(tǒng)一的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，這使得不同細(xì)胞膜色譜柱之間質(zhì)量差異較大，難以獲得理想的重現(xiàn)性。此外，細(xì)胞膜色譜作為一種生物色譜，其本身的柱效和理論塔板數(shù)都較低，因此，細(xì)胞膜色譜與二維色譜串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)合使用大大提升了其作為篩選工具的適用性和通量。

3.1 細(xì)胞膜色譜柱制備條件優(yōu)化

本課題組Ding等[5]對細(xì)胞膜色譜柱的制備過程中3個(gè)關(guān)鍵步驟（細(xì)胞用量、細(xì)胞破碎和裝柱流程）進(jìn)行了方法學(xué)考察和優(yōu)化，使細(xì)胞膜色譜柱壓更穩(wěn)定、柱效更高，并對細(xì)胞膜色譜模型的制備過程進(jìn)行了全面考察，建立起了一系列質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，為實(shí)驗(yàn)室制定了該項(xiàng)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，有效提高了細(xì)胞膜色譜模型制備的重現(xiàn)性。

細(xì)胞膜色譜柱在使用過程中，細(xì)胞膜表面的受體蛋白在使用過程中可能會發(fā)生失活，逐漸失去其原有的生物活性； 另一方面，固定相表面結(jié)合的細(xì)胞膜容易在流動(dòng)相的沖洗下脫落，以上兩個(gè)原因?qū)е录?xì)胞膜色譜柱的柱壽命較短，一般連續(xù)使用48～72 h后即失效。Ding等[5] 采用多聚甲醛處理鍵合了細(xì)胞膜的固定相，多聚甲醛可以與蛋白表面氨基交聯(lián)，同時(shí)使膜蛋白容易保持其空間構(gòu)型，經(jīng)此處理后細(xì)胞膜與硅膠的結(jié)合穩(wěn)定性得到顯著提高。然而，多聚甲醛作為一種蛋白交聯(lián)劑，可能會導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)破壞，活性下降，不能保證篩選結(jié)果的可靠性。因此，需要建立一種在不損傷細(xì)胞膜的同時(shí)，又能提高細(xì)胞膜在硅膠載體上的附著力的新方法。

Ding等[6]制備了一種3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane， APTES）修飾的硅膠，并應(yīng)用于細(xì)胞膜色譜的制備過程中，改變傳統(tǒng)的細(xì)胞膜和硅膠載體之間主要靠氫鍵和范德華力的非共價(jià)結(jié)合模式，實(shí)現(xiàn)了硅膠載體和細(xì)胞膜之間以共價(jià)鍵結(jié)合。如圖2所示，其原理是以APTES為橋梁，連接一個(gè)戊二醛增加連接臂長度，在硅膠表面鍵合了醛基基團(tuán)，而細(xì)胞膜是由豐富的磷脂組成的，含有大量氨基基團(tuán)，因此鍵合在硅膠表面的醛基與細(xì)胞膜上氨基在室溫環(huán)境中易發(fā)生醛氨縮合反應(yīng)，以共價(jià)鍵的形式結(jié)合，這大大提高了細(xì)胞膜在硅膠表面的附著力，同時(shí)又避免了對膜蛋白結(jié)構(gòu)的破壞。該方法提高了細(xì)胞膜在硅膠載體表面的穩(wěn)定性，降低了細(xì)胞膜脫落概率，有效延長了細(xì)胞膜色譜柱的使用壽命，從原有的不足3天延長到12天以上，此外，在柱活性下降最快的前3天，陽性藥吉非替尼的保留時(shí)間RSD也由20%下降到低于10%，重現(xiàn)性顯著提高。采用該方法制備的細(xì)胞膜色譜柱可用于一些難以培養(yǎng)、較難獲得的珍稀細(xì)胞，建立的模型可延長細(xì)胞膜生物活性，顯著提升了穩(wěn)定性，提高了細(xì)胞膜色譜柱適應(yīng)性。

3.2 細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)優(yōu)化

隨著分析儀器和分析方法的發(fā)展和進(jìn)步，細(xì)胞色譜分析系統(tǒng)也得到了不斷的更新和提升，從最開始的單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)到“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，以及近年發(fā)展的全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)。單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)無法對篩選得到的結(jié)果直接進(jìn)行分離和鑒定，在后續(xù)的分析過程中可能會丟失一些信息。而“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)具有自己的分析鑒定系統(tǒng)，彌補(bǔ)了單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)的不足，同時(shí)由離線發(fā)展到在線，減少了分析步驟，縮短了分析時(shí)間。而全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)在線、全自動(dòng)的分析過程，并可對細(xì)胞膜色譜柱中所有的組分進(jìn)行分離分析。

3.2.1 單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng) 單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，可以用細(xì)胞膜色譜柱作為分離分析系統(tǒng)，根據(jù)化合物在細(xì)胞膜色譜圖上的保留行為，篩選出潛在活性成分。單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)如圖3所示，將復(fù)雜體系的樣品進(jìn)樣到細(xì)胞膜色譜中，根據(jù)細(xì)胞膜色譜的分離分析功能將樣品進(jìn)行分離，在由檢測器給出保留行為圖譜。趙小娟等[7]制備了犬血管細(xì)胞膜色譜，對淫羊藿根與葉的活性成分進(jìn)行了分析比較，結(jié)果表明，淫羊藿根乙醚提取物在細(xì)胞膜色譜上有保留行為。進(jìn)一步將淫羊藿根乙醚提取液用高效液相色譜分離得到17個(gè)樣品，再用細(xì)胞膜色譜對該17個(gè)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有2個(gè)成分（YYH-214，YYH-216）和陽性藥維拉帕米一樣能在細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)上產(chǎn)生保留行為。張漢利等[8]應(yīng)用大鼠血管和心肌細(xì)胞膜色譜篩選出太白花中含有對主動(dòng)脈血管有舒張作用、對心肌收縮有抑制作用的有效成分。高琨等[9]采用大鼠血管細(xì)胞膜色譜篩選出紅毛七中對主動(dòng)脈血管有舒張作用的有效成分。該方法的不足之處在于無法對篩選得到的有效成分進(jìn)行直接分離和鑒定，需借助另一種分析系統(tǒng)進(jìn)一步對有效部位進(jìn)行分離分析，步驟繁瑣耗時(shí)，第一維色譜的信息有所丟失。

3.3.2 “中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng) 鑒于細(xì)胞膜色譜本身分離效能的局限性和檢測系統(tǒng)單一性的問題，單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)無法同時(shí)做到對有效活性組分的高效分離、快速識別和準(zhǔn)確鑒定，因此需借助快速的分離系統(tǒng)和高靈敏的檢測系統(tǒng)對活性組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離鑒定。為了實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析篩選活性成分，研究者發(fā)展了一種離線“中心切割”二維色譜離線分析方法，該方法的原理是將第一維的組分通過檢測器識別后，將潛在的活性組分分別收集，離線導(dǎo)入第二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）或氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）進(jìn)行離線分析。如文獻(xiàn)[10，11]采用血管內(nèi)皮細(xì)胞膜色譜-GC-MS方法篩選白芷、羌活、北沙參、蛇床子和五味子，發(fā)現(xiàn)歐前胡素、蛇床子素和五味子甲素對血管平滑肌細(xì)胞有舒張作用。文獻(xiàn)[12，13]采用腹腔巨噬細(xì)胞膜色譜-GC-MS方法篩選白術(shù)和羅田蒼術(shù)，發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯I對腹腔巨噬細(xì)胞有抗炎作用。然而，這種離線二維方法需要對色譜流份進(jìn)行收集和富集，步驟較為繁瑣，耗時(shí)較長。研究者又發(fā)展了一種“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜在線分析系統(tǒng)，樣品通過細(xì)胞膜色譜柱分離后可直接進(jìn)入MS系統(tǒng)進(jìn)行識別和鑒定，大大減少了工作量，縮短了分析時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)在線監(jiān)測分析，如CMC-online-HPLC/MS[14]。Li等[15]建立HEK293/VEGFR-CMC-online-HPLC/MS方法篩選烏頭中作用于VEGFR-2受體的抗癌活性成分有中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿。Sun等[16]建立A431/CMC-online-HPLC/MS方法篩選紅毛七總生物堿中作用于人EGFR受體活性成分有塔斯品堿和紅毛新堿。Wang等[17]建立α1AAR-CMC-online-HPLC/MS方法篩選紅毛七中作用于人α1A-腎上腺素受體的活性成分有木蘭花堿和紅毛新堿。Wang等[18]建立A431/CMC-online-HPLC/MS方法篩選苦參中EGFR受體拮抗劑有氧化苦參堿和苦參堿。Ren等[19]建立Prostate/CMC-online-HPLC/MS方法篩選蓮子心中作用于α1A-AR受體的具有抗前列腺癌作用的活性成分有蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿。研究表明，在線二維細(xì)胞膜色譜技術(shù)為中藥復(fù)雜體系中活性成分的快速篩選、同分異構(gòu)體的表征、動(dòng)物攝取中藥后體內(nèi)代謝產(chǎn)物的檢測提供了一種高效、快速、適用性強(qiáng)的方法體系[20]。

3.3.3 全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng) 目前，“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜模式仍存在下列問題：（1）第一維紫外檢測器的識別可能忽略一系列低紫外吸收的活性成分； （2）第二維使用常規(guī)的HPLC或GC-MS需要較長的分離分析時(shí)間； （3）常規(guī)質(zhì)譜定性能力弱，一般需要對照品來鑒別非靶標(biāo)組分，而中藥復(fù)雜成分標(biāo)準(zhǔn)品較難獲得，從而影響了細(xì)胞膜色譜分析的通量和準(zhǔn)確度。為解決上述問題，本課題組發(fā)展了一種新的全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)。Chen等[21]首次建立全二維HepG2肝癌/CMC/整體柱/TOFMS分析系統(tǒng)，并應(yīng)用于篩選黃柏和苦參中抗肝癌活性成分，該系統(tǒng)組成如圖4所示。全二維系統(tǒng)的第一維色譜是細(xì)胞膜色譜柱，由一個(gè)單元泵輸送流動(dòng)相10 mmol/L醋酸銨溶液，第二維色譜是反相色譜柱，由一個(gè)二元泵負(fù)責(zé)輸送流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)梯度洗脫。為實(shí)現(xiàn)第一維與第二維色譜同步分析，用一個(gè)十通閥將這兩維色譜橋連起來，并設(shè)置為每隔 2.5 min進(jìn)行自動(dòng)切換。在A和B 狀態(tài)的不斷切換過程中，第一維細(xì)胞膜色譜柱的全部組分都能夠進(jìn)入到第二維色譜分離柱中進(jìn)行分離，并串聯(lián)高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF/MS）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。在此全二維系統(tǒng)中，第一維組分可以全部流入第二維色譜柱中進(jìn)行進(jìn)一步的分離分析，因此，無需對第一維的組分進(jìn)行鑒定和表征，可利用第二維分離柱-TOF/MS強(qiáng)大的分離和鑒定能力，結(jié)合MATLAB工作站的數(shù)據(jù)處理和繪圖功能對有親和活性的組分進(jìn)行快速表征和鑒別，成功彌補(bǔ)“中心切割”二維色譜的一些缺陷和不足。在此基礎(chǔ)上，Chen等[22]建立正常/阿霉素誘導(dǎo)心衰比較全二維CMC/整體柱/TOF-MS方法篩選附子中抗阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭的活性成分，通過構(gòu)建正常大鼠的心肌組織細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)和衰竭大鼠的心肌組織細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)，比較附子提取液在兩者之間保留行為差異，從附子中成功篩選出16種心肌細(xì)胞膜結(jié)合成分和3種專屬性的抗心衰活性成分，比較全二維色譜圖譜如圖5所示。Wu等[23]建立全二維K562/CMC/C18柱/TOF-MS系統(tǒng)篩選青黛中抗白血病活性成分。Wang等[24]建立SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC18柱/TOF-MS系統(tǒng)，成功地對一系列人工合成的VEGFR抑制劑的活性進(jìn)行排序。考慮到在生物體內(nèi)的靶組織上實(shí)際起作用的活性成分不一定是小分子，也有可能是其代謝產(chǎn)物，全二維細(xì)胞膜色譜不僅可應(yīng)用于篩選中藥提取液中潛在活性成分，也適用于中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物的篩選。Jia等[25]建立了全二維HepG2 肝癌/CMC/C18柱/TOF-MS 分析系統(tǒng)，篩選口服黃芩提取液后的大鼠血清中抗肝癌活性成分。全二維分析系統(tǒng)通量高，準(zhǔn)確性、專屬性、適用性良好，極大提高了細(xì)胞膜色譜技術(shù)的分辨能力，且TOF-MS可提供每一個(gè)活性組分的精確質(zhì)量信息和豐富的離子碎片信息，在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的條件下也可以獲得可信的化合物鑒別分析結(jié)果，因此十分適用于中藥等天然藥物的復(fù)雜體系中有效的活性成分的篩選。

4 細(xì)胞膜色譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用

中藥及天然藥物中成分繁多且復(fù)雜，如何快速鑒定其中的活性組分一直是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的難題。隨著細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)的快速發(fā)展，細(xì)胞膜色譜法從中藥及天然藥物中篩選有效活性成分的應(yīng)用越來越廣泛。此外，二維細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)具有方法快速、操作簡捷、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系活性成分的篩選[26]。表1中列出了近年細(xì)胞膜色譜用于中藥活性成分篩選的應(yīng)用研究的統(tǒng)計(jì)和概述。

5 總結(jié)和展望

細(xì)胞膜色譜技術(shù)經(jīng)歷了二十余年的發(fā)展，多個(gè)課題組對細(xì)胞膜色譜制備方法學(xué)進(jìn)行了全面的考察和研究，其制備過程得到不斷的完善和優(yōu)化。重要的是，細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)從最開始的單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，發(fā)展到“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，再到全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，從離線發(fā)展到在線，不斷減少分析步驟、縮短分析時(shí)間，提高了準(zhǔn)確性和通量。大量研究表明，新型細(xì)胞膜色譜制備技術(shù)結(jié)合全二維色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜技術(shù)非常適用于復(fù)雜體系中活性成分的篩選。然而，在細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)中，為了保證分析的有效性，通常需要大量細(xì)胞（約3 × 107個(gè)）進(jìn)行色譜柱的制備，無法適用于原代細(xì)胞等難以獲得或擴(kuò)增的珍稀細(xì)胞系。Tang等[52]嘗試將細(xì)胞膜色譜搭載于在石英毛細(xì)管上，建立了毛細(xì)管細(xì)胞膜色譜，并應(yīng)用于篩選天然產(chǎn)物中活性成分； Zhang等[53]首次建立了開放管狀毛細(xì)管細(xì)胞膜色譜，具有與普通CMC相似的色譜保留因子和穩(wěn)定性，但細(xì)胞膜消耗量比CMC低數(shù)百倍。然而，這類開管的毛細(xì)管細(xì)胞膜色譜存在均一性低、無法與二維色譜、質(zhì)譜在線串聯(lián)等問題。因此，建立基于微型/nano色譜柱的細(xì)胞膜色譜多維分析系統(tǒng)是細(xì)胞膜色譜方法學(xué)發(fā)展的趨勢。同時(shí)，微型/nano色譜具有靈敏度高、細(xì)胞用量少、可陣列化等優(yōu)點(diǎn)，使得細(xì)胞膜色譜在高通量藥物-受體相互作用表征和化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。細(xì)胞膜色譜技術(shù)作為一種兼有色譜分離和活性篩選雙重特性的藥物活性分析方法，未來將向集成化、微型化、陣列化和自動(dòng)化的方向快速發(fā)展。

References

1 Hou X， Wang S， Zhang T， Ma J， Zhang J， Zhang Y， Lu W， He H， He L. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2014， 101： 141-150

2 HE Lang-Chong， GENG Xin-Du. Biomedical Chromatography Progress. Beijing： Chemical Industry Publishing House， 1996， 3： 8-9

賀浪沖， 耿信篤. 生物醫(yī)藥色譜進(jìn)展， 1991， 3： 8-9

3 He L C， Wang S C， Yang G D， Zhang Y M， Wang C H， Yuan B X， Hou X F. Drug Discov. Therapeut.， 2007， 1（2）： 104

4 HE Lang-Chong， YANG Guang-De， GENG Xin-Du. Chin. Sci. Bull.， 1999， 44（6）： 632-637

賀浪沖， 楊廣德， 耿信篤. 科學(xué)通報(bào)， 1999， 44（6）： 632-637

5 Ding X， Chen X， Cao Y， Jia D， Wang D， Zhu Z， Zhang J， Hong Z， Chai Y. J. Chromatogr. A.， 2014， 1359： 330-335

6 Ding X， Cao Y， Yuan Y， Gong Z， Liu Y， Zhao L， Lv L， Zhang G， Wang D， Jia D， Zhu Z， Hong Z， Chen X， Chai Y. Anal. Chem.， 2016， 88（24）： 12081-12089

7 ZHAO Xiao-Juan， DANG Gang-Chao， YANG Guang-De， HE Lang-Chong. Chinese J. Anal. Chem.， 2002， 30（2）： 195-197

趙小娟， 黨高潮， 楊廣德， 賀浪沖. 分析化學(xué)， 2002， 30（2）： 195-197

8 ZHANG Han-Li， YANG Gang-De， HE Lang-Chong， YANG Yin-Jing. Chin. Pharm. J.， 2003， 38（2）： 92-94

張漢利， 楊廣德， 賀浪沖， 楊銀京. 中國藥學(xué)雜志， 2003， 38（2）： 92-94

9 GAO Kun， HE Lang-Chong， YANG Guang-De. Chin. Pharm. J.， 2003， 38（1）： 14-16

高 琨， 賀浪沖， 楊廣德. 中國藥學(xué)雜志， 2003， 38（1）： 14-16

10 Hou X， Zhou M， Jiang Q， Wang S， He L. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（42）： 7081-7087

11 Yang X， Wang Y， Zhang X， Chang R， Li X. J. Sep. Sci.， 2011， 34（19）： 2586-2593

12 Wang C， He L， Wang N， Liu F. J. Chromatogr. B， 2009， 877（27）： 3019-3024

13 Li W， Niu X， Zhou P， Li M， He L. Chromatographia， 2011， 73（7-8）： 673-680

14 Li D， Wu D， Li S. J. Chromatogr. B， 2016， 1021： 81-90

15 Li M， Wang S， Zhang Y， He L. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2010， 53（4）： 1063-1069

16 Sun M， Ren J， Du H， Zhang Y， Zhang J， Wang S， He L. J. Chromatogr. B， 2010， 878（28）： 2712-2718

17 Wang L， Ren J， Sun M， Wang S. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2010， 51（5）： 1032-1036

18 Wang S， Sun M， Zhang Y， Du H， He L. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（32）： 5246-5252

19 Ren J， Dai D， Du H， Sun M， Wang S. Chromatographia， 2011， 74（5-6）： 375-381

20 Muhammad S， Han S， Xie X， Wang S， Aziz M M. J. Sep. Sci.， 2017， 40（1）： 299-313

21 Chen X， Cao Y， Lv D， Zhu Z， Zhang J， Chai Y. J. Chromatogr. A， 2012， 1242： 67-74

22 Chen X， Cao Y， Zhang H， Zhu Z， Liu M， Liu H， Ding X， Hong Z， Li W， Lv D， Wang L， Zhuo X， Zhang J， Xie X Q， Chai Y. Anal. Chem.， 2014， 86（10）： 4748-4757

23 Wu X， Chen X， Dan J， Cao Y， Gao S， Guo Z， Zerbe P， Chai Y， Diao Y， Zhang L. Sci. Rep.， 2016， 6： 25491

24 Wang D， Lv D， Chen X， Liu Y， Ding X， Jia D， Chen L， Zhu Z， Cao Y， Chai Y. J. Sep. Sci.， 2015， 38（24）： 4159-4165

25 Jia D， Chen X， Cao Y， Wu X， Ding X， Zhang H， Zhang C， Chai Y， Zhu Z. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2016， 118： 27-33

26 Brusotti G， Cesari I， Dentamaro A， Caccialanza G， Massolini G. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2014， 87： 218-228

27 Liu J， Wang S， Sun J， Shi J， Li Y， Gou J， Li A， He L. Fitoterapia， 2014， 93： 105-114

28 Han S， Zhang T， Huang J， Cui R， He L. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2014， 88： 602-608

29 Han S， Wei F， Huang J， Wang S. Anal. Lett.， 2014， 47（10）： 1661-1669

30 Yue Y， Xue H， Wang X， Yang Q， Song Y， Li X. J. Sep. Sci.， 2014， 37（3）： 244-249

31 Han S， Huang J， Hou J， Wang S. J. Sep. Sci.， 2014， 37（13）： 1525-1532

32 Guo Y， Han S， Cao J， Zhang T， He L. J. Sep. Sci.， 2014， 37（21）： 3188-3194

33 Zhang T， Han S， Liu Q， Guo Y， He L. J. Sep. Sci.， 2014， 37（22）： 3384-3391

34 Xue H， Cheng Y， Wang X， Yue Y， Zhang W， Li X. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2015， 115： 307-314

35 Yue Y， Dou L， Wang X， Xue H， Song Y， Li X. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2015， 115： 339-344

36 Li M， Wang S， He L. J. Chromatogr. B， 2015， 974： 9-16

37 Han S， Huang J， Cui R， Zhang T. J. Sep. Sci.， 2015， 38（4）： 585-591

38 Sun M， Hou X， Lin Y， Zhang J， Wang S. J. Sep. Sci.， 2015， 38（18）： 3145-3150

39 Zhang T， Ding Y， An H， Feng L， Wang S. J. Sep. Sci.， 2015， 38（18）： 3247-3253

40 Chen Y， Zhang N， Ma J， Zhu Y， Wang M， Wang X， Zhang P. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2016， 117： 178-183

41 Han S， Li C， Huang J， Wei F， Zhang Y， Wang S. J. Chromatogr. B， 2016， 1011： 158-162

42 Zhang Y， Liu F， Zhang X， Xu T， Quan W， Wang H， Shi J， Dai Z， Wu B， Wu Q. Biomed. Chromatogr.， 2016， 30（3）： 440-446

43 Tang C， Wu X D， Yu Y M， Duan H， Zhou J， Xu L. Biomed. Chromatogr.， 2016， 30（4）： 658-662

44 Fan J， Wei F， Zhang Y， Su H， Ji Z， He J， Han S. Pharm. Biol.， 2016， 54（2）： 279-284

45 Han S， Lv Y， Xue W， Cao J， Cui R， Zhang T. J. Sep. Sci.， 2016， 39（3）： 466-472

46 Wei F， Hu Q， Huang J， Han S， Wang S. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2017， 136： 134-139

47 Ma W， Zhu M， Zhang D， Yang L， Yang T， Li X， Zhang Y. Phytomedicine， 2017， 25： 45-51

48 Lv Y， Fu J， Shi X， Yang Z， Han S. J. Chromatogr. B， 2017， 1055-1056： 119-124

49 Lin Y， Wang C， Hou Y， He H， Huang L， Yang L， Sun M. Biomed. Chromatogr.， 2017： e4015

50 Lv Y， Sun Y， Fu J， Kong L， Han S. Biomed. Chromatogr.， 2017， 31（2）： DOI： 10.1002/bmc.3806

51 Wang Q， Xu J， Li X， Zhang D， Han Y， Zhang X. J. Sep. Sci.， 2017， 40（13）： 2688-2693

52 Tang C， Liu Z S， Qin N， Xu L， Duan H Q. Chromatographia， 2013， 76（11-12）： 697-701

53 Zhang F， Zhao X， Xu B， Cheng S， Tang C， Duan H， Xiao X， Du W， Xu L. Anal. Bioanal. Chem.， 2016， 408（10）： 2441-2448