王亞茹，王苑馨，胡軍，賈棟，高玲玲，馬瑞燕*

(1.山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；3.澳大利亞聯(lián)邦科學與工業(yè)研究組織，文布利 WA6913)

復雜的化學感受機制對于昆蟲的生存和行為至關重要[1]?；瘜W感受過程主要包括：嗅覺感知和味覺感知[2]。昆蟲通過嗅覺系統(tǒng)感知周圍環(huán)境中揮發(fā)性的化學信息物質并隨之產生相應的行為反應，例如尋找寄主植物、配偶，選擇產卵場所，躲避天敵等[3]。觸角是重要的嗅覺感受器官，將周圍環(huán)境中的化學信號轉變成電信號傳導到觸角葉中[4]。揮發(fā)性或脂溶性的化學信息物質首先通過觸角的微孔進入親水性的感器淋巴液,然后由相應的載體蛋白運輸?shù)礁杏X神經元樹突膜上的嗅覺受體 (olfactory receptors,ORs)[5]。這些載體蛋白主要包括兩類：化學感受蛋白(chemsensory proteins,CSPs)和氣味結合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)[6]?；瘜W感受蛋白CSPs也稱嗅覺特異性D蛋白(Olfactory specific-D,OS-D)或感覺附屬蛋白(sensory appendage proteins,SAPs)，高濃度存在于在觸角感器淋巴液中[7]。目前CSPs已經在多種昆蟲中被發(fā)現(xiàn)，包括鱗翅目、膜翅目、直翅目、蜚蠊目等[8]。

CSPs屬于小分子水溶性蛋白，分子量在13 kD左右，由100～115個氨基酸組成[9]。CSPs包含4個保守的半胱氨酸殘基，相鄰兩個半胱氨酸殘基形成二硫鍵[6]。這些二硫鍵各自成環(huán)，一個由8個氨基酸殘基環(huán)繞組成，另一個由4個半胱氨酸殘基環(huán)繞組成[10]。CSPs的N端特異性序列為YTTKYDN[-VI][ND][LV]DEIL、中部DGKELKXX(I/L)PDAL和C端KYDP。二級結構主要由α螺旋組成。昆蟲CSPs的初級結構和二級結構均高度保守[11]。這些保守的結構允許CSPs和長鏈的線性的化合物相互作用，例如油酰胺是蝗蟲CSPs的一種內源性配體[12]。CSPs的結構與功能具有密切聯(lián)系。目前僅有少數(shù)CSPs的三維結構被解析，包括甘藍夜蛾MamestrabrassicaeMbraCSP-A6、沙漠蝗SchistocercagregariaSgrCSP4、家蠶BombyxmoriBmorCSP1。CSPs是昆蟲識別環(huán)境中植物散發(fā)化學信息物質的重要嗅覺相關蛋白，如棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHarmCSP4對植物揮發(fā)物?-胡蘿卜素(?-carotene)具有高親和力[13]。

喜旱蓮子草Alternantheraphiloxeroides是全球性惡性雜草。由于其具有較強的生態(tài)適應、繁殖和傳播能力，20世紀30年代傳至我國后迅速蔓延，嚴重影響了我國農業(yè)、漁業(yè)、旅游業(yè)的發(fā)展，危害人畜健康[14]。從原產地引進專食性天敵蓮草直胸跳甲Agasicleshygrophila是治理入侵物種喜旱蓮子草的有效手段之一[15]。國內外安全性評估表明:該天敵專一性強，是良好的專食性模式昆蟲[15～18]。本課題組前期研究表明：該跳甲通過嗅覺感知兩種植物揮發(fā)物DMNT((E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene)和順-3-己烯醇((Z)-3-hexenol)的特殊比例來實現(xiàn)對寄主植物的識別和定位[19]。本研究擬通過生物信息學的方法對A.hygrophilaCSPs的理化性質、信號肽、亞細胞定位、跨膜結構、二級結構、高級結構、多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進行分析，以期為進一步研究其嗅覺反應的功能及分子機制提供理論依據(jù)，對于解析專食性天敵蓮草直胸跳甲對入侵性雜草喜旱蓮子草的識別和定位及外來物種的生態(tài)安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 供試昆蟲

蓮草直胸跳甲(A.hygrophila)引種于華南農業(yè)大學，由山西農業(yè)大學生物安全與生物防治研究基地種植的喜旱蓮子草(A.philoxeroides)進行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為溫度(25±1) ℃、相對濕度(75±5)%、光周期12 L∶12D的人工氣候箱。

1.2 方法

本研究利用第三代高通量測序技術對蓮草直胸跳甲進行了轉錄組測序，從蓮草直胸跳甲的轉錄組數(shù)據(jù)中篩出CSPs的核酸序列。

采用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)篩選出具有完整ORF的核酸序列，再用NCBI blastp對具有完整ORF的蛋白序列進行比對。利用ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)對蛋白質的分子量、理論pI、氨基酸組成、原子組成、消光系數(shù)、估計的半衰期、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)和總平均親水性參數(shù)進行計算。采用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽[20]。采用WOLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)進行蛋白質的亞細胞定位[21]。采用TMpred server (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進行蛋白質的跨膜區(qū)域預測。采用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)進行蛋白質的親疏水性預測。采用NetAcet 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/)進行蛋白質的乙?；稽c預測。YinOYang 1.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)進行蛋白質的O型糖基化位點預測。采用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)進行蛋白質的磷酸化位點預測。

采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)進行蛋白質的二級結構預測；SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質的三級結構模擬。采用DNAMAN軟件進行氨基酸的多序列比對。采用MEGA 5.0進行氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析，用Neighbor-Joining方法構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 蓮草直胸跳甲CSPs基因的NCBI BLAST結果

經ORFfinder與NCBI blastp后，蓮草直胸跳甲的轉錄組數(shù)據(jù)中19個CSPs被篩選出來(表1)。與蓮草直胸跳甲CSPs一致性較高的物種包括：榆黃毛螢葉甲Pyrrhalta.maculicollis、大猿葉蟲Colaphellus.bowringi、中歐山松大小蠹Dendroctonus.ponderosae、榆藍葉甲Pyrrhalta.aenescens、光肩星天牛Anoplophora.glabripennis、小蜂甲Aethina.tumida、黃曲條跳甲Phyllotreta.striolata、家蠅Musca.domestica和天蠶蛾Lonomia.oblique。由于CSPs的保守性較高，在目之間也具有很高的相似性。蓮草直胸跳甲19個CSPs中有17個與鞘翅目昆蟲的CSPs一致性最高，其余2個分別與雙翅目的家蠅和鱗翅目的天蠶蛾CSPs一致性最高。經blastp比對一致性較高的7種鞘翅目昆蟲中，與光肩星天牛CSPs的一致性最高(81%)。由于光肩星天牛與蓮草直胸跳甲同屬于鞘翅目葉甲科，因此一致性最高。蓮草直胸跳甲19個CSPs經blastp后發(fā)現(xiàn)有8個CSPs與小蜂甲、中歐山松大小蠹、家蠅、光肩星天牛的ejbp (Ejaculatory bulb-specific protein)一致性最高。

表1 蓮草直胸跳甲CSPs基因blastp比對Table 1 The best blastp match of Agasicles hygrophila CSPs

2.2 蓮草直胸跳甲CSPs基因編碼的蛋白一級結構及理化性質分析

經ExPASy-ProtParam tool預測后顯示(表2)，蓮草直胸跳甲19個CSPs氨基酸殘基數(shù)在69～144 aa，相對分子量8～13 kD。其中蓮草直胸跳甲CSP16氨基酸殘基數(shù)為335aa，昆蟲的CSPs一般由100個左右氨基酸組成，此蛋白可能為二聚體。蓮草直胸跳甲19個CSPs蛋白理論等電點位于7附近，表明這些蛋白屬于中性或偏酸偏堿性蛋白。蓮草直胸跳甲19個CSPs帶負電荷殘基總數(shù)與帶正電荷殘基總數(shù)基本相同。蓮草直胸跳甲CSPs中有12個不穩(wěn)定系數(shù)大于40，表明這些蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)反應蛋白的熱穩(wěn)定性，蓮草直胸跳甲19個CSPs均為熱穩(wěn)定性蛋白。蓮草直胸跳甲19個CSPs總平均疏水性均為負值，表明其CSPs均為親水性蛋白。

表2 蓮草直胸跳甲CSPs蛋白理化性質Table 2 The physicochemical properties of Agasicles hygrophila CSPs

2.3 蓮草直胸跳甲CSPs的信號肽分析

采用SignalP 4.1 Server進行信號肽預測后，給出C、Y、S計測結果(表3)，綜合這5個分值可判斷蛋白質是否含有信號肽。蓮草直胸跳甲19個CSPs中有15個含有信號肽，4個CSPs的D平均值在0.1附近，不具有信號肽剪切位點，因此不含有信號肽。昆蟲的CSPs高濃度存在于感器淋巴液中，為分泌型蛋白，一般含有信號肽。信號肽對于引導蛋白質前體到達正確的位置并發(fā)展為成熟的蛋白質進而發(fā)揮相應的功能具有重要作用。

2.4 蓮草直胸跳甲CSPs的亞細胞定位

采用WOLF PSORT對蓮草直胸跳甲CSPs進行蛋白質的亞細胞定位(表4)，結果顯示蓮草直胸跳甲19個CSPs除AhygCSP16可能位于細胞核和細胞質外，其余CSPs均可能位于胞外(Extracellular)，即為分泌型蛋白(Secreted protein)，這與昆蟲CSPs高濃度存在于感器淋巴液中相符合。

表3 蓮草直胸跳甲的CSPs信號肽Table 3 The signal peptide of Agasicles hygrophila CSPs

2.5 蓮草直胸跳甲CSPs的跨膜區(qū)域

采用TMpred進行蛋白質的跨膜區(qū)域預測(圖1)，19個蓮草直胸跳甲CSPs除AhygCSP16含有約25個氨基酸左右的跨膜區(qū)域外，其余18個蓮草直胸跳甲CSPs均不含跨膜區(qū)域。AhygCSP16的跨膜區(qū)域可能為α螺旋(Alpha helix)。

圖1 蓮草直胸跳甲CSP16的跨膜區(qū)域Fig.1 The transmembrane region of Agasicles hygrophila CSP16

2.6 蓮草直胸跳甲CSPs的二級結構及結構域分析

采用SOPMA進行蛋白質的二級結構預測(圖2)。蓮草直胸跳甲的CSPs的二級結構主要由α螺旋(Alpha helix)和無規(guī)卷曲(Random coil)組成，蛋白質的二級結構是由殘基之間的氫鍵來調節(jié)相互作用的。蓮草直胸跳甲CSPs二級結構以α螺旋和無規(guī)卷曲為主，形成疏水性的結合腔。相鄰兩個保守半胱氨酸殘基之間的二硫鍵導致α螺旋的形成并維持穩(wěn)定的結構。CSPs的一級和二級結構在不同種昆蟲之間高度保守。蛋白質的一級結構所具有的理化性質和二級結構的特征與空間結構的形成有密切關系。

表4 蓮草直胸跳甲的CSPs亞細胞定位Table 4 The subcellular localization of Agasicles hygrophila CSPs

圖2 蓮草直胸跳甲CSPs的二級結構Fig.2 The secondary structure of Agasicles hygrophila CSPs注：豎線顏色及對應二級結構:藍色豎線為α螺旋、綠色豎線為β折疊、紫色豎線為無規(guī)卷曲、紅色豎線為延伸鏈Note:The vertical line color and the corresponding secondary structure：The blue line is Alpha helix、The green line is Beta turn、The purple line is Random coil、The red line is Eetended strand

2.7 蓮草直胸跳甲CSPs的蛋白親疏水區(qū)域

采用Protscale進行蛋白質的親疏水性預測(附圖1)，結果顯示19個蓮草直胸跳甲CSPs均屬于親水性蛋白。每個蓮草直胸跳甲CSPs只有一小部分氨基酸序列是疏水性序列，其余氨基酸序列均為親水性序列。蓮草直胸跳甲CSPs親疏水性氨基酸的含量和分布與高級結構的形成有密切關系。蓮草直胸跳甲CSPs的高級結構與其在昆蟲體內所處的微環(huán)境以及發(fā)揮相應的功能具有密切聯(lián)系。

2.8 蓮草直胸跳甲CSPs蛋白的多序列比對

采用DNAMAN進行蛋白質的多序列比對(圖3)，蓮草直胸跳甲16個CSPs均由4個保守的半胱氨酸殘基組成，且第1個和第2個半胱氨酸殘基間隔6個氨基酸殘基，兩個半胱氨酸殘基通過二硫鍵形成8個氨基酸的環(huán)。第3個和第4個半胱氨酸殘基間隔2個氨基酸殘基，兩半胱氨酸殘基通過二硫鍵形成4個氨基酸的環(huán)。蓮草直胸跳甲CSPs基本符合昆蟲CSPs的3個高度保守的結構域：N端YTTKYDN(V/l)(N/D)(L/V)DEIL、中部DGKELKXX(I/L)PDAL和C端KYDP。CSPs通過這3個高度保守的結構域來維持折疊形成疏水性的結合腔保證其穩(wěn)定性。

2.9 蓮草直胸跳甲CSPs的三級結構預測

采用SWISS-MODEL進行蛋白質的同源建模。昆蟲的CSPs拓撲結構和保守結構均有明顯的特點，CSPs的氨基酸序列折疊形成疏水性的結合腔在種和屬之間都是高度保守的，CSPs種內也具有很高的保守性。蓮草直胸跳甲CSPs同源建模結果(圖4)，AhygCSP2、AhygCSP3、AhygCSP4、AhygCSP5、AhygCSP8、AhygCSP9、AhygCSP10、AhygCSP12、AhygCSP13、AhygCSP14、AhygCSP15、AhygCSP18、AhygCSP19經SWISS-MODEL建模后三維結構相似。AhygCSP1、AhygCSP16經SWISS-MODEL建模后三維結構相似。AhygCSP6、AhygCSP7、AhygCSP11、AhygCSP17與其他蓮草直胸跳甲CSPs差異較大。蓮草直胸跳甲CSPs三維結構形成一個親水的表面和一個疏水的空腔，疏水空腔與其識別、結合運載脂溶性配體相契合。三維結構相似的CSPs可能具有相同或相似的功能。

2.10 蓮草直胸跳甲CSPs蛋白的磷酸化、糖基化、乙?；稽c

采用NetAcet 1.0 Server、YinOYang 1.2和NetPhos 3.1 Server對蓮草直胸跳甲CSPs進行磷酸化、乙?；?、糖基化位點分析后可知(表4)，蓮草直胸跳甲CSPs具有絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的磷酸化位點；具有絲氨酸、蘇氨酸的糖基化位點；具有絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸的乙?；稽c。蓮草直胸跳甲CSPs的磷酸化位點相對于糖基化、乙?；稽c來說數(shù)目較多。蓮草直胸跳甲CSPs絲氨酸的乙?；稽c數(shù)目較少，除AhygCSP12、AhygCSP16分別有1個絲氨酸的乙?；稽c外，其余蓮草直胸跳甲CSPs均不具有絲氨酸的乙?；稽c。蓮草直胸跳甲CSPs有機體需要糖分子/糖鏈與其他分子相互作用發(fā)揮生物學作用。磷酸化多具有功能開關作用，具體功能蛋白被磷酸化后才具備調控功能代謝的作用。

2.11 蓮草直胸跳甲CSPs的聚類分析

采用MEGA 5.0對7個目16種昆蟲的99個CSPs氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，用Neighbor-Joining法構建進化樹，Bootstrap進行1000次重復(圖5)。圖中所示進化樹同源性均大于50%。昆蟲的CSPs因目而聚類的情況比較明顯，鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、雙翅目、直翅目、蜚蠊目、竹節(jié)蟲目7個目的昆蟲分別在進化樹上聚于不同的分支。鞘翅目的蓮草直胸跳甲A.hygrophila的CSPs與赤擬谷盜Triboliumcastaneum在進化樹上聚于同一分支；鱗翅目的家蠶Bombyxmori、甘藍夜蛾Mamestrabrassicae、煙芽夜蛾Heliothisvirescens、煙草天蛾Manducasexta、云杉色卷蛾Choristoneurafumiferana的CSPs在進化樹上聚于同一分支；膜翅目的意蜂Apismellifera、歐洲馬蜂Polistesdominula、阿根廷螞蟻Linepithemahumile的CSPs在進化樹上聚于同一分支；直翅目的東亞飛蝗Locustamigratoria、沙漠蝗Schistocercagregaria在進化樹上聚于同一分支。蓮草直胸跳甲19個CSPs中有9個與鞘翅目的赤擬谷盜CSPs在進化樹上聚于同一分支，親緣關系較近。昆蟲的CSPs保守性比較高，在不同種之間也有40%～50%的同源性。蓮草直胸跳甲的AhygCSP3、AhygCSP19與鞘翅目的赤擬谷盜TcasCSP1、膜翅目的意蜂AmelCSP2、鱗翅目的家蠶BmorCSP16在進化樹上聚于同一分支；AhygCSP6、AhygCSP7與鱗翅目的家蠶BmorCSP12在進化樹上聚于同一分支；AhygCSP810、AhygCSP13、AhygCSP18與BmorCSP1、BmorCSP6在進化樹上聚于同一分支；AhygCSP4與鱗翅目的BmorCSP11、BmorCSP13、CfumCSP1在進化樹上聚于同一分支；AhygCSP17與直翅目的沙漠蝗SgreCSP6在進化樹上聚于同一分支，親緣關系較近。在進化樹上聚于不同支的CSPs一般具有不同的功能，這與昆蟲長期適應復雜的環(huán)境從而進化出多樣的功能有關。

圖3 蓮草直胸跳甲CSPs的多序列比對Fig.3 The multiple sequence alignment of Agasicles hygrophila CSPs注：CSPs氨基酸序列及GenBank登錄號:苜蓿盲蝽(ACZ58023.1);顏色及對應一致性：紅色表示一致性≥75%;綠色表示 一致性≥50%。Note:The sequence of CSPs and their GenBank accession number：Adelphocoris lineolatus (ACZ58023.1)；Color and corresponding identity:The red indicate identity≥75%；The green indicate identity≥50%.

3 討論與結論

經ORFfinder和NCBI blastp從蓮草直胸跳甲的轉錄組數(shù)據(jù)中篩出19個蓮草直胸跳甲CSPs。蓮草直胸跳甲CSPs是一種外分泌親水性蛋白，分子量在8～13kD，由69～144個氨基酸組成，理論等電點位于7附近，大部分是不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)比較高，熱穩(wěn)定性較強。CSPs一般具有信號肽，這對蛋白質前體正確跨膜、轉運、定位并發(fā)揮相應的功能具有重要的作用。蓮草直胸跳甲CSPs一般不具有跨膜結構，這與CSPs為分泌蛋白有關。蓮草直胸跳甲CSPs主要由4個保守的半胱氨酸殘基組成，第1個和第2個半胱氨酸殘間隔6個氨基酸殘基，第3個和第4個半胱氨酸殘基間隔2個氨基酸殘基。4個半胱氨酸殘基通過兩個互不連鎖的二硫鍵分別形成兩個氨基酸環(huán)。蓮草直胸跳甲的CSPs符合一般昆蟲CSPs具有的3個高度保守的結構域：N端YTTKYDN(V/l)(N/D)(L/V)DEIL、中部DGKELKXX(I/L)PDAL和C端KYDP。蓮草直胸跳甲CSPs親疏水性氨基酸的含量和分布與高級結構的形成有密切關系。蓮草直胸跳甲CSPs的二級結構主要由α螺旋(Alpha helix)和無規(guī)卷曲(Random coil)組成。CSPs的三級結構形成親水表面和疏水空腔，這與CSPs適應周圍微環(huán)境識別結合脂溶性配體有關。蓮草直胸跳甲的CSPs形成后要經過磷酸化、乙?；?、糖基化等翻譯后修飾才能發(fā)展為成熟蛋白質并發(fā)揮相應的功能。蓮草直胸跳甲CSPs保守性較高，在目之間具有很高的相似性，與其他鞘翅目昆蟲的CSPs具有較高的同源性。

圖4 蓮草直胸跳甲CSPs三級結構Fig.4 The tertiary structure of Agasicles hygrophila CSPs

表4 蓮草直胸跳甲CSPs蛋白的磷酸化、糖基化、乙?；稽c數(shù)目Table 4 The number of phosphorylation,glycosylation and acetylation sites of Agasicles hygrophila CSPs

圖5 基于NJ法構建的蓮草直胸跳甲CSPs和其他昆蟲CSPs的進化樹Fig.5 The neighbor-joining(NJ) tree of Agasicles hygrophila CSPs with homologous proteins from other insect species based on the amino acid sequences注：符號及對應目Symbols and corresponding orders:○:鱗翅目Lepidoptera;●:鞘翅目Coleoptera;△:膜翅目Hymenoptera;▽:雙翅目Diptera;◇:直翅目Orthoptera;◆:蜚蠊目Blattaria;▲:竹節(jié)蟲目Phasmida.;物種名簡稱及對應全稱Species abbreviation and corresponding universal names:蓮草直胸跳甲Ahyg:A.hygrophila;黑腹果蠅 Dmel:D.melanogaster;家蠶 Bmor:Bombyx mori;甘藍夜蛾 Mbra:M.Brassicae:煙芽夜蛾 Hvir:H.virescens;煙草天蛾 Msex:M.sexta;云杉色卷蛾 Cfum:C.fumiferana;意蜂 Amel:A.mellifera;歐洲馬蜂 Pdom:P.dominula;阿根廷螞蟻 Lhum:L.humile;東亞飛蝗 Lmig:L.migratoria;沙漠蝗 Sgre:S.gregaria;東方螻蛄 Gori:G.orientalis;美洲大蠊 Pame:P.Americana;竹節(jié)蟲 Ecal:E.calcarata;赤擬谷盜 Tcas:T.castaneum.CSPs氨基酸序列及GenBank登錄號 The sequence of CSPs and their GenBank accession number:DmelOS-D10(aAAA21 358.1);DmelA10(AAC46 473.1);DmelCSP10(AAF49 381.1);DmelOS-D(AAC46 473.1);DmelejbpA(NP_524 966.1);DmelejbpB(NP_001 286 808.1);DmelejbpC(NP_001 286 809.1);BmorCSP1(ABH88 194.1);BmorCSP2(ABH88 195.1);BmorCSP3(BAF34 351.1);BmorCSP4(BAF34 352.1);BmorCSP5(BAF34 353.1);BmorCSP7(BAF34 355.1);BmorCSP9(BAF34 357.1);BmorCSP10(BAF34 358.1);BmorCSP11(BAF34 359.1);BmorCSP12(ABH88 205.1);BmorCSP13(ABH88 206.1);BmorCSP14(ABH88 207.1);BmorCSP15(NP_001 091 781.1);BmorCSP16(ABH88 209.1);MbraSAP3(AAK14 793.1);MbraCSP1(AAF71 290.2);MbraCSP2(AAF71 289.1);HvirCSP1(AAM77 041.1);HvirCSP2(AAM77 040.1);HvirCSP3(AAM77 042.1);HvirCSP4(ACX53 745.1);MsexSAP1(AAF16 696.1);MsexSAP2(AAF16 714.1);MsexSAP3(AAF16 707.1);MsexSAP4(AAF16 721.1);CfumCSP1(AAR84 077.1);CfumCSP2(AAR84 078.1);CfumCSP3(AAR84 079.2);CfumCSP4(AAW23 971.1);AmelCSP1(ABH88 169.1);AmelCSP2(ABH88 170.1);AmelCSP3(ABH88 171.1);AmelCSP4(ABH88 172.1);AmelCSP5(ABH88 173.1);AmelCSP6(ABH88 174.1);PdomCSP(AAP55 719.1);LhumCSP(AAN01 363.1);LmigCSP1(CAB65 181.1);LmigCSP2(CAB65 180.1);LmigCSP3(CAB65 179.1);LmigCSP4(CAB65 178.1);LmigCSP5(CAB65 177.1);SgreOS-D(AAP57 461.1);SgreCSP1(AAC25 399.1);SgreCSP2(AAC25 400.1);SgreCSP3(AAC25 401.1);SgreCSP4 (AAC25 402.1);SgreCSP5(AAC25 403.1);SgreCSP6(AAT39 531.1);Gori(AAQ85 057.1);Pame(AAB84 283.1);EcalCSP1(AAD30 550.1);EcalCSP2(AAD30 551.1);EcalCSP3(AAD30 552.1);TcasCSP1(ABH88 175.1);TcasCSP2(ABH88 176.1);TcasCSP3(EFA07 417.1);TcasCSP4(ABH88 177.1);TcasCSP5(ABH88 178.1);TcasCSP6(ABH88 179.1);TcasCSP7(ABH88 180.1);TcasCSP8(ABH88 181.1);TcasCSP9(ABH88 182.1);TcasCSP10(ABH88 183.1);TcasCSP11(ABH88 184.1);TcasCSP12(ABH88 185.1);TcasCSP13(ABH88 186.1);TcasCSP14(ABH88 187.1);TcasCSP15(ABH88 188.1);TcasCSP16(ABH88 189.1);TcasCSP17(ABH88 190.1);TcasCSP18(ABH88 191.1);TcasCSP19(ABH88 192.1);TcasCSP20(ABH88 193.1).

利用SWISS-MODEL進行同源建模是研究蛋白質三維結構的重要手段。CSPs三維結構的構象及關鍵氨基酸殘基與昆蟲的趨性行為有密切的聯(lián)系[22]。研究表明苜蓿盲蝽A.lineolatusCSP5的異亮氨酸Ile67參與對3-己酮(3-Hexanone)、3,4-二甲基苯甲醛(3,4-Dinethylbenzaldehyde)的識別，而這兩種小分子化學物質是棉花的主要揮發(fā)性綠葉氣成分和基本的花香物質，是植物的最基本的物質，在植食性昆蟲定位寄主植物的過程中發(fā)揮作用[23～25]。經多序列比對發(fā)現(xiàn)，AlinCSP5與AhygCSP1、AhygCSP2、AhygCSP5、AhygCSP6、AhygCSP7、AhygCSP9、AhygCSP11、AhygCSP12、AhygCSP14、AhygCSP15、AhygCSP16均具有該保守的異亮氨酸殘基Ile。AlinCSP5經SWISS-MODEL進行結構模擬后發(fā)現(xiàn)由6個α螺旋組成，通過兩個V型的結構形成結合腔。除AhygCSP6、AhygCSP7、AhygCSP11、AhygCSP17外，其余蓮草直胸跳甲CSPs均具有與其相似的構象。因此AhygCSP1、AhygCSP2、AhygCSP5、AhygCSP9、AhygCSP12、AhygCSP14、AhygCSP15、AhygCSP16具有與AlinCSP5相似的構象和關鍵的氨基酸位點，可能參與寄主植物釋放的揮發(fā)性綠葉氣和花香物質的識別。

蓮草直胸跳甲的NCBI blastp結果顯示19個CSPs中AhygCSP1、AhygCSP2、AhygCSP3、AhygCSP6、AhygCSP12、AhygCSP14、AhygCSP15、AhygCSP19與小蜂甲、中歐山松大小蠹、家蠅、光肩星天牛的ejbp (ejaculatory bulb-specific protein)一致性最高。由于黑腹果蠅在分泌雄性性信息素醋酸酯vaccenyl acetate的射精管ejb(ejaculatoryducl bulb)中表達CSPs[26]，參與儲存并釋放性信息素[27]。因此，AhygCSP1、AhygCSP2、AhygCSP3、AhygCSP6、AhygCSP12、AhygCSP14、AhygCSP15、AhygCSP19可能表達于化學感受器官射精管ejb中，參與結合并釋放性信息素。CSPs不僅在嗅覺器官如觸角中表達，而且在非嗅覺器官如胸、腹、足、翅、喙、足、上頜骨觸須、唇須、下顎須及性腺中也有很高的表達量[6，28，29]。CSPs廣泛表達于昆蟲各種化學感受器官中，它的表達分布與功能多樣性相關，CSPs可同時位于不同部位參與識別環(huán)境中的化學信號[27]。因此AhygCSP1、AhygCSP2、AhygCSP12、AhygCSP14、AhygCSP15可能同時參與識別植物釋放的揮發(fā)性綠葉氣成分和昆蟲釋放的性信息素。

由于CSP表達分布具有多樣性，因此CSPs除具有嗅覺方面的功能外，還具有其他方面的功能：(1)釋放化學信號：果蠅CSP EjB-III (Ejaculatory bulb protein III)在產生性信息素醋酸酯(Vaccenyl acetate)的器官——射精管(ejaculatory bulb)中參與結合和釋放性腺和精液中的雄性性信息素[26]。甘藍夜蛾(M.brassicae) CSPMbraA6和CSPMbraB1參與結合生殖腺中疏水性化學物質并釋放到周圍環(huán)境中[30]。東亞飛蝗(Locustamigratoria)LmigCSP91特異性表達于雄性生殖器官而在雌性生殖器官中沒有表達，對性信息素有很高的親和力，作為轉運蛋白在交配時轉移信息素[31]。(2)發(fā)育：沙漠蝗(Schistocercamigratoria) CSPs與其獨居型向群居型轉變有關[32]；美洲大蠊(Periplanetaamericana) CSPs與足的再生有關[33，34]。蜜蜂CSP5特異性表達于卵巢、卵，與胚胎的發(fā)育有關[35]。紅火蟻(Solenopsisinvicta) CSP9在三齡幼蟲末期表達量最高，影響脂肪酸的合成和表皮的發(fā)育[36]。(3)免疫：對家蠶(Bombyxmori)施以亞致死計量的殺蟲劑，腸道中的一些CSPs顯著上調，CSPs參與分離和屏蔽有毒的殺蟲劑分子形成復合物通過糞便排出體外[22，37]。

綜上所述，AhygCSP1、AhygCSP2、AhygCSP12、AhygCSP14、AhygCSP15可能參與識別植物釋放的揮發(fā)性綠葉氣成分。CSPs是寄主植物識別和定位的重要嗅覺相關蛋白。本課題組研究表明蓮草直胸跳甲是通過嗅覺感知兩種植物揮發(fā)物DMNT ((E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene)和順-3-己烯醇((Z)-3-hexenol)的特殊比例來實現(xiàn)對喜旱蓮子草的識別和定位[19]。因此我們將進一步對AhygCSP1、AhygCSP2、AhygCSP5、AhygCSP9、AhygCSP12、AhygCSP14、AhygCSP15、AhygCSP16進行嗅覺反應的功能及分子機制研究，以期解析專食性天敵蓮草直胸跳甲對入侵性雜草喜旱蓮子草的識別和定位，確保生態(tài)安全。

CSPs與環(huán)境中的化學信號分子結合后穿過親水性的觸角感器淋巴液到達感覺神經元樹突膜上的氣味受體，將化學信號轉變成電信號傳遞到昆蟲的觸角葉產生相應的行為反應[38]。嗅覺信號決定植食性昆蟲的寄主偏好性[19]。蓮草直胸跳甲是從原產地引進用來防治入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵[18]。寄主專一性和潛在的寄主轉移是用來篩選和評估生防作用物的重要標準[19]。植食性甲蟲蓮草直胸跳甲是利用兩種植物揮發(fā)物DMNT((E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene)和順-3-己烯醇((Z)-3-hexenol)的特殊比例來區(qū)分寄主植物喜旱蓮子草和非寄主植物的[19]。雖然植食性雌性甲蟲蓮草直胸跳甲是通過區(qū)分許多化合物來區(qū)別寄主植物和非寄主植物的，DMNT和順-3-己烯醇不足以改變它的取食和產卵偏好，但在寄主植物喜旱蓮子草上施加順-3-己烯醇和非寄主植物蓮子草(Alternantherasessilis)上施加DMNT卻可以導致植食性甲蟲蓮草直胸跳甲在非寄主植物蓮子草上進行產卵和孵化[19]。因此通過區(qū)分嗅覺信號可導致生防作用物所不期望的寄主范圍擴張，此種現(xiàn)象代表著重要潛在寄主轉移的警告和生防作用物侵襲力的發(fā)展[19]。外來引進物種蓮草直胸跳甲通過CSPs來感知環(huán)境中的嗅覺信號來識別入侵性雜草喜旱蓮子草從而保證它的專食性具有重要意義。如果蓮草直胸跳甲不能通過識別嗅覺信號來定位寄主植物可能會出現(xiàn)潛在的寄主轉移(攻擊非靶標植物的現(xiàn)象)從而引發(fā)生物安全的問題，使生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和安全性受到威脅[39]。因此研究外來引進物種蓮草直胸跳甲通過嗅覺相關蛋白CSPs來感知周圍環(huán)境中的化學信號從而實現(xiàn)寄主植物的識別和定位具有重要意義。研究嗅覺編碼的功能及分子機制對于確保蓮草直胸跳甲的專食性從而保證生態(tài)安全具有重要作用，蓮草直胸跳甲CSPs的生物信息學分析為深入研究蓮草直胸跳甲CSPs的嗅覺編碼的功能及分子機制提供了理論依據(jù)。

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