孫志浩，霍昭光，張寶全，楊志曉，衛(wèi)宣志，喻奇?zhèn)ィ顣暂x，楊鐵釗*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002；2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州 310008；3.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081；4.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700）

煙草的多酚類物質(zhì)是重要的次生代謝物質(zhì)之一[1-2]，煙葉中多酚類物質(zhì)主要有綠原酸、蕓香苷和莨菪亭[3-5]。煙葉中多酚類物質(zhì)含量較高，約占干重的0.5%～2.5%[6]。多酚類物質(zhì)對(duì)煙草的生理生化活動(dòng)、煙葉的色澤、卷煙的香吃味、生理強(qiáng)度等都有重要的影響[7]。多酚類物質(zhì)是香氣前體物質(zhì)，可分解生成多種致香物質(zhì)，如：糠醛、5-羥甲基糠醛和4-甲基兒茶酚等。也可與蛋白質(zhì)結(jié)合或經(jīng)多酚氧化酶催化發(fā)生棕色化反應(yīng)等[8-10]。

煙葉多酚類物質(zhì)含量受多種因素影響，海拔高度是重要的影響因素之一。劉鵬飛等[11]對(duì)濃香型產(chǎn)區(qū)的8個(gè)省的煙葉多酚類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蕓香苷含量與海拔高度呈極顯著正相關(guān)，莨菪亭含量與海拔高度呈極顯著負(fù)相關(guān)。對(duì)不同煙區(qū)和不同品種間煙葉的分析表明，在一定范圍內(nèi)，海拔越高煙葉中的多酚類物質(zhì)越多[12-16]；不同品種初烤煙葉多酚類物質(zhì)含量存在不同程度的差異。雖然海拔高度對(duì)煙草多酚物質(zhì)含量的影響已有較多的研究[17-18]，但是關(guān)于海拔高度與品種互作對(duì)烤煙多酚含量和組成影響的研究較少。為此，本試驗(yàn)在貴州畢節(jié)煙區(qū)設(shè)置3個(gè)不同海拔高度，種植3個(gè)不同烤煙品種，研究海拔高度、品種及其互作對(duì)烤煙多酚類物質(zhì)含量的影響，以期為特色優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2015年在貴州省畢節(jié)市威寧縣（高海拔2200 m）、納雍縣（中海拔1600 m）和七星關(guān)區(qū)（低海拔1000 m）進(jìn)行，在3個(gè)地區(qū)均種植烤煙品種紅花大金元、畢納1號(hào)和K326。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小區(qū)面積150 m2，行距1.10 m，株距0.55 m，施用純氮6.8 kg/667m2。3地均使用煙草專用復(fù)合肥，由畢節(jié)市煙草公司提供，具體施肥方式如下：基肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)＝10∶12∶13]30 kg/667m2、酒糟有機(jī)肥40 kg/667m2于起壟當(dāng)天施于壟底，提苗肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)＝15∶8∶7）]5 kg/667m2于移栽當(dāng)天隨水施入，追肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)＝13∶0∶26]20 kg/667m2于移栽15 d隨水施入煙株根部。3個(gè)海拔試驗(yàn)地均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)管理方式進(jìn)行田間管理。

1.3 試劑和儀器

試劑：甲醇（色譜純，美國(guó)J T Baker公司）、乙酸（分析純，天津市達(dá)森化工有限公司）。

標(biāo)樣：純度大于97%的綠原酸、蕓香苷、莨菪亭標(biāo)樣（美國(guó)sigma公司）。

儀器：高效液相色譜（美國(guó)Waters公司）。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

取外觀質(zhì)量均勻一致的初烤煙葉（C3F），將樣品去梗切絲后在40℃下干燥12 h，碾子研磨，過(guò)40目篩，密封置于冰箱中（?10℃）中。

采用YC/T 202—2006[19]方法測(cè)定烤煙中的綠原酸、蕓香苷、莨菪亭，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)崔黨群[20]的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，利用SPSS11.5和Excel 2007等軟件對(duì)所測(cè)定的多酚類物質(zhì)進(jìn)行方差分析和圖表繪制，并采用LSD法對(duì)不同品種間、海拔高度及組合間進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同海拔高度、品種間多酚類物質(zhì)含量的差異分析

對(duì)海拔高度與品種及不同組合間多酚類物質(zhì)含量進(jìn)行多重比較和互作效應(yīng)分析。結(jié)果（表1）表明，煙葉中的綠原酸在3個(gè)海拔高度間存在顯著差異，高海拔地區(qū)綠原酸含量最高（15.47 mg/g），中海拔地區(qū)含量最低（13.68 mg/g），低海拔地區(qū)介于兩者之間。蕓香苷含量在3個(gè)海拔高度間存在顯著差異，且隨著海拔高度的升高其含量顯著增加。莨菪亭含量在3個(gè)海拔高度間也存在一定的差異，低海拔地區(qū)莨菪亭含量顯著高于高海拔和中海拔地區(qū)，而在高海拔地區(qū)與中海拔地區(qū)差異不顯著。

表1 不同海拔高度間多酚類物質(zhì)含量差異Table1 The effects of different altitudes on polyphenols of tobacco mg/g

表2表明，3個(gè)品種間綠原酸含量均存在顯著性差異，其中紅花大金元綠原酸含量最高為21.01 mg/g，K326次之，畢納1號(hào)含量最低。蕓香苷含量在3個(gè)品種間存在一定的差異，畢納1號(hào)蕓香苷含量最高為9.10 mg/g，K326蕓香苷含量最低為7.57 mg/g，紅花大金元蕓香苷含量介于兩者之間。莨菪亭含量在3個(gè)品種間均存在顯著性差異，畢納1號(hào)含量最高為0.31 mg/g，紅花大金元和K326莨菪亭含量分別為0.16和0.14 mg/g。

表2 不同品種間多酚類物質(zhì)含量差異Table 2 The effects of different varieties on polyphenols of tobacco mg/g

2.2 不同組合間多酚類物質(zhì)含量差異分析

對(duì)不同組合間多酚類物質(zhì)進(jìn)行多重比較（表3），品種與海拔高度之間的不同組合煙葉綠原酸含量差異顯著。紅花大金元×高海拔的綠原酸含量（27.65 mg/g）顯著高于其他組合，其次是紅花大金元×中海拔、紅花大金元×低海拔、K326×中海拔；而畢納1號(hào)×中海拔和K326×高海拔的綠原酸含量顯著低于其他的組合。

蕓香苷含量在不同組合間有顯著性差異，畢納1號(hào)×高海拔的蕓香苷含量（12.62 mg/g）顯著高于其他組合。K326×低海拔和畢納1號(hào)×低海拔組合的蕓香苷含量均顯著低于其他組合。

表3 不同組合間多酚類物質(zhì)含量差異Table3 The variance of polyphenols content in different combinations mg/g

莨菪亭含量在不同組合間存在一定的顯著性差異，畢納1號(hào)×低海拔的莨菪亭含量（0.38 mg/g）高于其他組合，其次為畢納1號(hào)×高海拔、畢納1號(hào)×中海拔、紅花大金元×中海拔。組合K326×低海拔、K326×高海拔、紅花大金元×高海拔含量明顯低于其他組合。

2.3 不同組合間多酚類物質(zhì)含量互作效應(yīng)分析

通過(guò)對(duì)不同品種與不同海拔高度之間多酚類物質(zhì)含量的互作效應(yīng)分析可知（表4～6），綠原酸含量的互作效應(yīng)差異較大，5個(gè)組合為正效應(yīng)，4個(gè)組合為負(fù)效應(yīng)。紅花大金元品種在高海拔地區(qū)有較高的正向互作效應(yīng)值（5.85 mg/g），但在低海拔地區(qū)也有較大的負(fù)向效應(yīng)值（?4.13 m/g）。K326在中海拔地區(qū)有較高的正向互作效應(yīng)（4.62 mg/g），但在高海拔地區(qū)的負(fù)向互作效應(yīng)值最大（?6.18 mg/g）。說(shuō)明紅花大金元在高海拔地區(qū)有利于綠原酸含量的積累，而K326在中海拔地區(qū)有利于綠原酸含量的積累，其他組合的互作效應(yīng)值相對(duì)較小。

表4 海拔、品種互作對(duì)綠原酸含量的效應(yīng)分析Table 4 Chlorogenic acid interactions between altitude andvariety

由表5可知，蕓香苷含量在品種間與海拔高度間的互作效應(yīng)值差異較大。5個(gè)組合為正效應(yīng)，4個(gè)組合為負(fù)效應(yīng)。紅花大金元在低海拔地區(qū)有最大的正向互作效應(yīng)值（1.37 mg/g），在中海拔地區(qū)有較大的負(fù)向互作效應(yīng)值（?1.02 mg/g）。畢納1號(hào)在高海拔地區(qū)有較大的正向互作效應(yīng)值（1.09 mg/g），但在低海拔地區(qū)有較大的負(fù)向互作效應(yīng)值（?1.46 mg/g）。

表5 海拔、品種互作對(duì)蕓香苷含量的效應(yīng)分析Table 5 Rutin interactions between altitude and variety

由表6可知，莨菪亭含量在品種間和海拔高度間的互作效應(yīng)差異較大，6個(gè)組合為正效應(yīng)，3個(gè)組合為負(fù)效應(yīng)。畢納1號(hào)在低海拔地區(qū)有較大的正向互作效應(yīng)值（2.14 mg/g），在中海拔地區(qū)有較大的負(fù)向互作效應(yīng)值（?1.52 mg/g）。紅花大金元和K326在中海拔地區(qū)有正向互作效應(yīng)值，分別為1.22和0.33 mg/g。但紅花大金元在高海拔地區(qū)有較大的負(fù)向互作效應(yīng)值（?1.25 mg/g）。說(shuō)明畢納1號(hào)在低海拔地區(qū)有利于莨菪亭的積累，但在中海拔地區(qū)不利于莨菪亭的積累，而K326、紅花大金元在中海拔地區(qū)有利于莨菪亭的積累。

2.4 海拔高度及品種對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)含量貢獻(xiàn)率分析

方差分析結(jié)果表明（表7），煙葉多酚類物質(zhì)含量在不同海拔高度、品種及互作間的差異均達(dá)到顯著水平。說(shuō)明海拔高度、品種及海拔與品種互作均對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)含量有影響。品種對(duì)綠原酸含量的貢獻(xiàn)率最大，占總變異的57%；其次為品種與海拔高度互作，占總變異的41%；海拔高度的貢獻(xiàn)率最低，僅占2%。海拔高度對(duì)蕓香苷含量的貢獻(xiàn)率最大，占總變異的74%，其次為海拔高度與品種互作，占總變異的15%，品種影響最小，僅占8.0%；海拔高度與品種互作對(duì)莨菪亭含量的貢獻(xiàn)率最大，占總變異的48%，海拔高度次之，占總變異的30%，品種對(duì)莨菪亭含量影響最小。

表6 海拔、品種互作對(duì)莨菪亭含量的效應(yīng)分析Table 6 Scopoletin interactions between altitude and variety

表7 海拔高度與品種互作對(duì)烤煙多酚類物質(zhì)的影響雙因素方差分析Table 7 Tests of bi-factorial variance analysis of effects of altitude and variety on polyphenols of flue-cured tobacco

3 討論

海拔高度是影響煙葉多酚類物質(zhì)含量的重要因素。隨著海拔高度的增加蕓香苷含量顯著提高，而綠原酸和莨菪亭含量隨海拔高度變化的規(guī)律性不明顯。這可能與3種多酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，蕓香苷較綠原酸和莨菪亭含有較多的σ-π、p-π共軛體系，共軛體系長(zhǎng)，且蕓香苷環(huán)上氧化程度高于綠原酸和莨菪亭，對(duì)紫外光的吸收范圍較寬[18,21-22]，而隨著海拔高度的升高，由于輻射增強(qiáng)[23]、生育期內(nèi)有效積溫下降、晝夜溫差大，高海拔地區(qū)的生態(tài)特點(diǎn)能促進(jìn)蕓香苷合成和積累。本研究結(jié)論也證明，海拔高度對(duì)蕓香苷含量提高的貢獻(xiàn)率達(dá)74%，這可能也是清香型煙葉形成的生態(tài)與化學(xué)基礎(chǔ)之一。

綠原酸是多酚類物質(zhì)的主要組成成分，占多酚類物質(zhì)總量的60%以上。分析表明品種間差異大于海拔間差異，品種的遺傳特性對(duì)綠原酸含量起主導(dǎo)作用（貢獻(xiàn)率為57%）。因此，通過(guò)選擇或改良品種來(lái)調(diào)控?zé)熑~綠原酸含量效果會(huì)更為顯著。

由于多酚類物質(zhì)中的不同組分對(duì)海拔和品種的響應(yīng)存在著差異，因此深入分析和認(rèn)識(shí)海拔與品種間的互作效應(yīng)更顯重要。在參試的3個(gè)品種中，綠原酸、蕓香苷含量均以紅花大金元的主效應(yīng)最大，且與高海拔地區(qū)互作效應(yīng)顯著，這可能是紅花大金元種植在高海拔地區(qū)清香型特色較為突出的原因之一。K326品種無(wú)論是綠原酸、蕓香苷，還是莨菪亭含量均表現(xiàn)為與中海拔互作效應(yīng)值最大，低海拔次之。因此，要提高K326品種煙葉多酚類物質(zhì)含量，種植在中低海拔地區(qū)效果會(huì)更好。畢納1號(hào)品種是貴州地區(qū)的特色烤煙品種，研究發(fā)現(xiàn)畢納1號(hào)在低海拔地區(qū)綠原酸、莨菪亭含量較高。所以要提高畢納1號(hào)煙葉多酚類物質(zhì)含量，種植在低海拔地區(qū)較為適宜。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，綠原酸含量主要受品種影響較大，其次為海拔與品種互作，蕓香苷含量主要受海拔高度的影響，莨菪亭含量主要受海拔高度與品種互作的影響。針對(duì)本試驗(yàn)參試的3個(gè)品種來(lái)說(shuō)，畢納1號(hào)在低海拔地區(qū)種植綠原酸與莨菪亭含量最高，在高海拔地區(qū)種植蕓香苷含量最高。紅花大金元在高海拔地區(qū)種植綠原酸、蕓香苷含量最高。K326在中海拔地區(qū)種植綠原酸、莨菪亭含量最高。因此，在現(xiàn)有的海拔高度基礎(chǔ)上種植與其相適宜的品種類型，發(fā)揮海拔高度對(duì)多酚類物質(zhì)含量與組成的最大潛力是提高烤煙品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

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