林麗明， 張美金， 許昌聲， 林金秀

(1莆田學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 福建 莆田 351100； 2福建醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院， 3福建省高血壓研究所，4福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科， 福建 福州 350000)

以動脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)的糖尿病(diabetes mellitus，DM)大血管并發(fā)癥是糖尿病患者的首位死亡原因，而長期高糖(high glucose，HG)暴露導致的血管內(nèi)皮氧化損傷被認為是其促進動脈粥樣硬化發(fā)生的起始事件[1]。目前研究認為，高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增多主要來源于線粒體和NADPH氧化酶2個途徑[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素D(vitamin D，VitD)的活性代謝產(chǎn)物骨化三醇能夠延緩糖尿病ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的進展，并且這一作用與其抑制PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑ROS的生成，進而減輕高糖誘導的血管內(nèi)皮氧化凋亡有關(guān)[3-4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，高糖能夠通過上調(diào)脯氨酰異構(gòu)酶1(prolyl isomerase 1，Pin1)的蛋白表達和活性，催化胞漿內(nèi)Ser36位點磷酸化的促氧化銜接蛋白p66Shc發(fā)生順反異構(gòu)，異構(gòu)化的p66Shc在蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的作用下去磷酸化，進入線粒體(Pin1介導p66Shc線粒體轉(zhuǎn)位)，進而氧化細胞色素C，誘導線粒體途徑ROS的生成，促進炎癥反應(yīng)，減少NO生成，共同損害血管內(nèi)皮功能[5]。相反，Pin1抑制劑胡桃醌(juglone)被證實能夠改善糖尿病小鼠的血管內(nèi)皮功能障礙。因此，本研究擬以胡桃醌為陽性對照藥物，在細胞水平觀察維生素D能否通過激動維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)，抑制高糖環(huán)境下Pin1的表達和活性增加，減少p66Shc線粒體轉(zhuǎn)位和線粒體途徑ROS的生成，從而減輕高糖誘導的內(nèi)皮氧化損傷。

材 料 和 方 法

1 材料

骨化三醇(上海瓦蘭生物科技有限公司)；M199 培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液和Trizol (Invitrogen)；OPTI-MEM(Gibco)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2-DCFDA)、二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)和I 型膠原酶(Sigma)；鼠抗人Pin1、p-p66Shc、p66Shc、caspase-3、β-actin及細胞色素C氧化酶亞基4(cytochrome C oxidase subunit 4，COX4)單克隆抗體(TCS)；線粒體蛋白提取試劑盒(貝博生物)。

2 方法

2.1人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 的培養(yǎng) 參照文獻[6]的方法，取新生健康嬰兒臍帶，采用膠原酶消化法原代培養(yǎng)HUVECs，依據(jù)細胞典型的鋪路石樣生長形態(tài)及免疫熒光法檢測細胞Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定HUVECs，取傳3～6代的HUVECs進行實驗。

2.2HUVECs分組和干預 用HG(33 mmol/L葡萄糖)刺激內(nèi)皮細胞，體外模擬糖尿病患者的體內(nèi)高糖環(huán)境，等濃度甘露醇作為陰性對照以排除HG的滲透壓效應(yīng)。將細胞分為對照(control)組(33 mmol/L 甘露醇)、HG組(33 mmol/L葡萄糖)、HG+VitD組(33 mmol/L葡萄糖+10-8～10-6mol/L維生素D)和HG+胡桃醌組(33 mmol/L葡萄糖+10-7mol /L胡桃醌)，干預72 h。

2.3TUNEL法測HUVECs的凋亡 按試劑盒說明進行操作。著色棕黃色表示凋亡的細胞核, 鏡下隨機記數(shù)5 個高倍視野(×400)中的凋亡細胞數(shù), 求其均值。

2.4流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率 去除細胞培養(yǎng)液，PBS 洗1次，0.25%胰酶消化后用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，1 200 r/min離心6 min后棄上清，PBS 洗1次，用預冷的80%乙醇固定，-20 ℃可放置1月，待標本集齊后離心去除固定液，加PBS 洗2次，100 μL PBS重懸細胞，加RNase 10 μL(5 g/L)，37 ℃作用30 min后, 加入20 μL PI染色液(500 mg/L，5 mg PI+0.1 mL Triton X-100+3.7 mg EDTA+10 mL PBS)，4 ℃避光染色30 min, 上機前加400 μL PBS，每份樣品記數(shù)10 000個細胞，計算凋亡細胞的百分比。

2.5流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS的水平 各組細胞干預結(jié)束后，于培養(yǎng)液內(nèi)加入10 μmol /L H2-DCFDA，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60 min，吸去培養(yǎng)液，用預溫的PBS洗細胞1次，再用0.25% 胰酶-EDTA消化細胞制成細胞懸液。采用525 nm濾光片進行流式細胞術(shù)檢測各標本的陽性細胞比例和熒光強度。

2.6熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS的熒光強度 于干預結(jié)束后的細胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L DHE，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。用預溫的PBS 沖洗2～3 次，去除殘余的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)ROS 的熒光強度。

2.7Western blot法檢測蛋白表達水平 提取細胞總蛋白、胞漿蛋白和線粒體蛋白(根據(jù)線粒體蛋白提取試劑盒說明書操作)，煮沸10 min變性，采用12% SDS-PAGE分離50 μg 蛋白樣品，轉(zhuǎn)至PVDF膜后用特異的抗Pin1、p-p66Shc、p66Shc、caspase-3、β-actin和COX4單克隆抗體進行Western blot檢測，β-actin作為總蛋白內(nèi)參照，COX4作為線粒體蛋白內(nèi)參照。

2.8多肽酶解法測定HUVECs內(nèi)Pin1的活性 細胞生長至60%～70%融合時，棄上清，加1 mL細胞裂解緩沖液(50 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，0.25% CHAPS，5 mmol/L NaF，1 mmol/L β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L EDTA)，4 ℃超聲儀振蕩裂解；配制含93 μL HEPES緩沖液[50 mmol/L HEPES (pH 7.8)，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，0.04 g/L BSA]、5 μL細胞裂解液(1×105細胞數(shù)或0.25 nmol的Pin1標準品)和 2 μL(20 g/L)胰蛋白酶的混合液；加50 μL H-Trp-Phe-Tyr-Ser (PO3H2)-ProArg-pNA(720 μmol/L，NeoMPS)起始反應(yīng)，390 nm分光光度儀檢測4 min，記錄吸光度(A)，Pin1活性以各組細胞與空白對照組A值的相對比值表示。

2.9siRNA的設(shè)計和轉(zhuǎn)染VDRsiRNA序列：正義鏈為5’-CAAUCUGGAUCUGAGUGAAdTdT-3’，反義鏈為5’-UUCACUCAGAUCCAGAUUGdTdT-3’；對照siRNA(scrambled)序列：正義鏈為5’-UUGUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。所有siRNA序列均由Sigma公司合成，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間的兩兩均數(shù)比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 VitD抑制高糖誘導的 HUVECs凋亡

VitD(10-8～10-6mol/L)可抑制高糖條件下HUVECs凋亡；與高糖組相比，當VitD濃度為10-7mol/L， HUVECs凋亡率顯著降低(P<0.05)；VitD濃度為10-6mol/L與10-7mol/L之間HUVECs凋亡率有顯著差異(P<0.05)，故選取10-6mol/L為VitD的工作濃度進行后續(xù)實驗，見圖1。

Figure 1. VitD treatment attenuated the apoptosis of HUVECs induced by high glucose. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHG group；△P<0.05vsHG+VitD (10-7mol/L) group.

圖1VitD抑制高糖誘導的HUVECs凋亡

2 VitD對高糖誘導的HUVECs凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示：control組細胞排列緊密，僅見少量細胞胞核內(nèi)呈棕黃色；高糖(33 mmol/L)干預72 h后，細胞排列松散，有大量細胞胞核呈棕黃色；VitD(10-6mol/L)和胡桃醌(10-7mol/L)處理組細胞排列均較為緊密，只有少量細胞胞核呈棕黃色，見圖2A。流式細胞儀凋亡分析顯示，與高糖組比較，VitD(10-6mol/L)和胡桃醌(10-7mol/L)均可顯著抑制高糖誘導HUVECs凋亡(P<0.05)，見圖2B。

3 VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs內(nèi)Pin1蛋白水平及活性的影響

以VitD (10-8～10-6mol/L)預處理45 min加高糖(33 mmol/L)條件下共孵育HUVECs 72 h，結(jié)果顯示，VitD可抑制高糖(33 mmol/L)條件下HUVECs內(nèi)Pin1蛋白表達及活性水平增加；與高糖組相比，當VitD濃度達到10-7mol/L時，HUVECs內(nèi)Pin1蛋白表達及活性水平均顯著降低(P<0.05)，VitD濃度為10-6mol/L時，Pin1蛋白表達及活性水平進一步降低(P<0.05)，見圖3。

4 VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs促氧化銜接蛋白p66Shc磷酸化水平及其線粒體轉(zhuǎn)位的影響

高糖能誘導HUVECs內(nèi)促氧化銜接蛋白p66Shc磷酸化，與control組相比，高糖組HUVECs內(nèi)p66Shc磷酸化水平顯著增加(P<0.05)；VitD能抑制高糖誘導HUVECs胞內(nèi)p66Shc磷酸化，與高糖組相比，VitD(10-6mol/L)組HUVECs內(nèi)p66Shc磷酸化水平顯著降低(P<0.05)； VitD(10-6mol/L)組HUVECs內(nèi)p66Shc的磷酸化水平與胡桃醌(10-7mol/L)組相比差異無統(tǒng)計學顯著性；各組p66Shc總蛋白水平之間的差異也無統(tǒng)計學顯著性，見圖4A。此外，高糖還能誘導HUVECs內(nèi)p66Shc發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位，與control組相比，高糖組HUVECs線粒體內(nèi)p66Shc水平顯著增加，胞漿的p66Shc水平顯著減少(P<0.05)；VitD能抑制高糖誘導HUVECs內(nèi)p66Shc發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位，與高糖組相比，VitD組(10-6mol/L)HUVECs線粒體內(nèi)p66Shc水平顯著降低(P<0.05)，胞漿p66Shc水平顯著增加(P<0.05)；VitD(10-6mol/L)組與胡桃醌(10-7mol/L)組HUVECs中p66Shc線粒體轉(zhuǎn)位水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4B。

Figure 2. Effect of VitD (10-6mol/L) treatment on the apoptosis of HUVECs induced by high glucose. A： TUNEL staining of HUVECs (×400； arrow indicates TUNEL-positive nucleus); B： the apoptosis of HUVECs measured by flow cytometry. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHG group.

圖2VitD(10-6mol/L)對高糖培養(yǎng)HUVECs凋亡的影響

5 VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs中ROS生成的影響

熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS的熒光強度：高糖條件下HUVECs中ROS產(chǎn)生的紅色熒光強度增強，VitD(10-6mol/L)和胡桃醌(10-7mol/L)均可抑制高糖條件下HUVECs中ROS產(chǎn)生的紅色熒光強度，見圖5A。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：高糖能誘導HUVECs中ROS生成，與control組相比，高糖組HUVECs中ROS生成明顯增加(P<0.05)；VitD能抑制高糖誘導HUVECs中ROS生成，與高糖組相比，VitD組ROS生成水平顯著降低(P<0.05)；VitD和胡桃醌組之間ROS生成水平的差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖5B。

6 VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs中caspase-3蛋白水平的影響

與control組相比，高糖組HUVECs內(nèi)caspase-3蛋白水平顯著增加(P<0.05)；與高糖組相比，VitD組HUVECs內(nèi)caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)；VitD組和胡桃醌組HUVECs內(nèi)caspase-3蛋白水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖6。

7 VDR介導VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs中Pin1蛋白表達及活性增加的抑制作用

用特異性的VDRsiRNA轉(zhuǎn)染HUVECs之后，發(fā)現(xiàn)VitD對高糖誘導HUVECs中Pin1蛋白及活性水平的抑制作用顯著減弱(P<0.05)，與VitD(10-6mol/L)組相比，VDRsiRNA+HG+VitD(10-6mol/L)組的Pin1蛋白及活性水平均顯著升高(P<0.05)，而scrambled siRNA+HG+VitD(10-6mol/L)組與HG+VitD(10-6mol/L)組之間Pin1蛋白及活性水平無顯著變化，見圖7。

Figure 3. VitD treatment abrogated upregulation of Pin1 expression (A) and activity (B) in HUVECs induced by high glucose. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHG group；△P<0.05vsHG+VitD (10-7mol/L) group.

圖3VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs內(nèi)Pin1蛋白水平和活性的影響

討 論

內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化形成的起始事件。高糖通過誘導內(nèi)皮氧化損傷，促進糖尿病大血管并發(fā)癥發(fā)生。高糖環(huán)境下內(nèi)皮ROS生成增多主要有線粒體和NADPH氧化酶2個途徑，且以線粒體途徑為主。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，VitD能夠部分通過抑制高糖誘導的NADPH氧化酶途徑ROS生成，延緩糖尿病性血管病變進展[3-4]。然而，VitD能否抑制線粒體途徑ROS生成，目前未見研究報道。本研究在細胞水平證實了VitD可以通過抑制高糖誘導的Pin1表達和活性增加，減少p66Shc介導的線粒體途徑ROS生成，減輕內(nèi)皮細胞氧化損傷，并且這一過程依賴于VDR的激活。

Figure 4. Effects of VitD treatment on phosphorylation (A) and mitochondrial translocation (B) of p66Shc in high glucose-cultured HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHG group.

圖4VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs中促氧化銜接蛋白p66Shc磷酸化及線粒體轉(zhuǎn)位的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下PKCβ被激活，后者使胞漿內(nèi)p66Shc在Ser36位點磷酸化，進而被Pin1識別并異構(gòu)化，異構(gòu)化的p66Shc在PP2A的作用下去磷酸化，進入線粒體(Pin1介導p66Shc線粒體轉(zhuǎn)位)，活化的p66Shc轉(zhuǎn)移到線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ，氧化細胞色素C產(chǎn)生更多的ROS并誘導細胞經(jīng)線粒體途徑凋亡[7]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠敲除Pin1基因或接受Pin1抑制劑胡桃醌治療，可以減輕線粒體氧化應(yīng)激和血管炎癥，改善血管內(nèi)皮功能，提示抑制Pin1蛋白和活性可能是糖尿病血管病變防治新靶點[5, 8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與胡桃醌相似，VitD能夠抑制高糖環(huán)境Pin1高表達和活性增加，減少線粒體途徑ROS生成和凋亡蛋白caspase-3表達。既往有關(guān)VitD與線粒體氧化應(yīng)激之間的關(guān)系研究較少。Sinha等[9]首次提出，VitD可以提高線粒體活性，改善肌肉功能。近期Uberti等[10]研究發(fā)現(xiàn)，維生素D預處理能夠穩(wěn)定線粒體膜電位，減少超氧陰離子生成，抑制細胞色素C釋放和caspase激活，減輕過氧化氫誘導的HUVECs死亡，然而該研究仍未能闡明VitD保護線粒體功能的機制。因此，本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進一步闡明了VitD防治糖尿病血管病變的新機制，并揭示了Pin1蛋白在這一過程的重要作用。

Figure 5. Effect of VitD treatment on intracellular ROS levels in high glucose-cultured HUVECs. A: intracellular ROS levels in HUVECs observed by fluorescence microscopy (×400); B: intracellular ROS levels in HUVECs measured by flow cytometry. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHG group；△P<0.05vsHG+VitD (10-6mol/L) group.

圖5VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs內(nèi)ROS生成的影響

Figure 6. Effect of VitD treatment on caspase-3 protein expression in high glucose-cultured HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHG group.

圖6VitD對高糖培養(yǎng)HUVECs中caspase-3蛋白表達的影響

本研究主要存在以下不足之處，首先，本研究未能進一步檢測線粒體超氧陰離子、線粒體膜電位以及線粒體DNA損傷等指標，以進一步細化闡明VitD的抗線粒體氧化應(yīng)激作用；其次，本研究未進一步深入探討VitD通過何種途徑抑制高糖誘導的Pin1蛋白表達和活性增加，進而發(fā)揮抗線粒體氧化應(yīng)激作用；再次，因時間關(guān)系，本研究未能進一步驗證VitD對糖尿病患者血管功能的影響。因此，未來仍亟待大量的研究工作以進一步闡明VitD與Pin1/p66Shc介導的線粒體氧化應(yīng)激之間的相互關(guān)系以及是否能夠改善糖尿病患者的血管功能。

Figure 7. Role of VDR in the inhibitory effects of VitD on high glucose-induced upregulation of Pin1 expression and activity. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHG group；△P<0.05vsHG+VitD (10-6mol/L)+scrambled siRNA group.

圖7VDR對VitD抑制高糖誘導的HUVECs中Pin1蛋白表達及活性增加的影響

綜上所述，VitD通過激動VDR受體，抑制高糖環(huán)境下Pin1蛋白表達和活性增加，抑制p66Shc線粒體轉(zhuǎn)位，減少ROS生成，從而減輕血管內(nèi)皮細胞氧化凋亡。我們的研究進一步闡明了維生素D抗氧化效應(yīng)的機制，為維生素D用于防治糖尿病血管病變提供新的理論依據(jù)。

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