王紅鋼， 孫偉力， 鐘培育， 吳東棟， 王 軍， 蔡 歡， 王國(guó)英， 喬 玲， 張 濤， 李彥章

(1河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2河南大學(xué)民生學(xué)院， 河南 開(kāi)封 475004)

炎癥小體(inflammasome)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的組成成分,是一種多蛋白復(fù)合體，可識(shí)別病原微生物和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，即病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式等蛋白復(fù)合物，通過(guò)激活半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)，誘導(dǎo)促炎因子白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-18成熟和分泌，調(diào)控炎癥反應(yīng)，抵抗病原體感染和應(yīng)激損傷，但其過(guò)度活化可導(dǎo)致組織器官炎癥損傷[1-2]。其中NLRP3炎癥小體由NOD樣受體家族成員NLRP3、接頭蛋白ASC和pro-caspase-1組成，是目前研究最多最透徹的炎癥小體。已確認(rèn)NLRP3炎癥小體在很多疾病的炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此，NLRP3炎癥小體已成為眾多炎癥疾病治療藥物開(kāi)發(fā)的探索靶點(diǎn)。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的氣體信號(hào)分子，在脂代謝和心肌細(xì)胞損傷等生理病理過(guò)程中起重要作用，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)以半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產(chǎn)生[3-4]，具有重要的抗炎作用[5]。目前，H2S在炎癥中的作用已被廣泛研究，但其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道，本文用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激人肝細(xì)胞L02和SMMC-7721建立炎癥模型，用硫氫化鈉(sodium hydrosulfide hydrate，NaHS)釋放外源性H2S施加干預(yù)來(lái)研究H2S對(duì)NLRP3炎癥小體的影響，以期為研發(fā)NLRP3炎癥小體靶向的抗炎藥物提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

L02細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)；DMEM和胎牛血清購(gòu)自Gibco；脫脂奶粉購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞分組 將細(xì)胞分為4組：對(duì)照(control)組、LPS組、LPS+NaHS組和NaHS組。對(duì)照組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)18.5 h；LPS組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)0.5 h后，再用LPS(100 μg/L)刺激18 h；LPS+NaHS組用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后，再用LPS刺激18 h；NaHS組用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后，再用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h。

2.2MTT法檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)兩種肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 將肝細(xì)胞以1×107/L的濃度接種于96孔板中，每孔0.2 mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，周邊孔不加液體以去除邊緣效應(yīng)，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液換為含不同濃度(0、100、200、500和1 000 μg/L)LPS的培養(yǎng)基誘導(dǎo)肝細(xì)胞18 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液 20 μL，培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO振蕩5 min，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光度(A)值，細(xì)胞活力(%)=(處理組A值/對(duì)照組A值)×100%。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用冷的PBS清洗細(xì)胞3遍，然后每孔加入200 μL RIPA裂解液，混勻后室溫靜置10 min，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，在冰上振蕩裂解5 min，然后12 000×g、4 ℃離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的1.5 mL的離心管中，按照BCA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)蛋白濃度。檢測(cè)后的蛋白樣品經(jīng)變性處理后用于SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將膠放在轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min，然后組裝成“三明治”的形式，100 V、轉(zhuǎn)膜45～60 min，完成后取出PVDF膜，用TBS清洗10～15 min。 I 抗(NLRP3和caspase-1)用含有脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000)，加至PVDF膜室溫孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，再加入HRP標(biāo)記 II抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，加入顯色液照相保存結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)分析兩組均數(shù)間的差異，采用單因素方差分析檢驗(yàn)多組均數(shù)間的差異，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度LPS對(duì)細(xì)胞活力的影響

為確定建立炎癥模型所用LPS是否對(duì)細(xì)胞活力有影響，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的LPS分別刺激L02細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞18 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0 μg/L LPS)相比，濃度100～500 μg/L 的LPS對(duì)2種肝細(xì)胞均無(wú)毒性作用，見(jiàn)圖1。

2 不同濃度LPS對(duì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響

為檢測(cè)LPS的促炎效果，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的LPS刺激L02細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞18 h后，用Western blot 檢測(cè)NLRP3炎癥小體的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，用濃度為100 μg/L的LPS刺激細(xì)胞，NLRP3和caspase-1在兩種細(xì)胞中的表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖2、3。綜合以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇LPS的濃度為100 μg/L。

Figure 1. MTT assay was used to measure the effect of LPS at different concentrations on the viability of SMMC-7721 cells and L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

圖1不同濃度LPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞和L02細(xì)胞活力的影響

Figure 2. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

圖2Westernblot檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)L02細(xì)胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影響

Figure 3. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L

圖3Westernblot檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影響

3 外源性H2S對(duì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的影響

本實(shí)驗(yàn)用NaHS作為H2S的釋放劑，Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，LPS組的NLRP3和caspase-1表達(dá)明顯增高，而LPS+NaHS組中的NLRP3和caspase-1表達(dá)比LPS組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

Figure 4. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vscontrol group；*P<0.05vsLPS group.

圖4外源性H2S對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中炎癥小體NLRP3蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P< 0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

圖5外源性H2S對(duì)L02細(xì)胞中炎癥小體NLRP3表達(dá)的影響

討 論

LPS是革蘭氏陰性菌表達(dá)的內(nèi)毒素，可識(shí)別Toll樣受體4，激活炎癥信號(hào)通路，上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達(dá)[6-7]。采用LPS刺激產(chǎn)生炎癥是常見(jiàn)的建立炎癥模型的方法，本文MTT結(jié)果顯示低濃度的LPS可不明顯地升高肝細(xì)胞活力，但高劑量的LPS會(huì)對(duì)細(xì)胞活力有顯著抑制作用，綜合Western blot結(jié)果確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用LPS濃度為100 μg/L。

H2S是哺乳動(dòng)物體內(nèi)繼一氧化氮和一氧化碳之后被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子，以前一直被認(rèn)為是有毒氣體，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，H2S具有重要的抗炎作用。研究表明，給予外源性H2S可明顯改善缺血引起的心肌炎癥損傷，減少炎癥介質(zhì)的釋放[8-9]，外源性H2S還可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠原代心肌細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[10]，通過(guò)抗炎作用減輕缺血再灌注引起的胃黏膜細(xì)胞損傷[11]。雖然近年來(lái)有關(guān)H2S的研究很多，但在人肝細(xì)胞中，關(guān)于H2S與NLRP3炎癥小體的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)研究表明，NLRP3在肝炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用，用半乳糖神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)野生型小鼠和NLRP3敲除小鼠建立炎癥模型，結(jié)果顯示在NLRP3敲除小鼠中，肝細(xì)胞中的IL-6 和TNF-α等炎癥介質(zhì)以及血漿中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶比野生小鼠顯著減少[12]，持續(xù)的乙型肝炎病毒感染可抑制肝細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達(dá)，加重肝臟損傷[13]。本文在L02細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞炎癥模型的基礎(chǔ)上研究H2S對(duì)胞中NLRP3炎癥小體的影響，結(jié)果顯示給予外源性H2S后，細(xì)胞中炎癥小體NLRP3和caspase-1表達(dá)均顯著減弱，初步證明外源性H2S可抑制人肝細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的表達(dá)，說(shuō)明H2S具有作為抗炎藥物的潛在價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)是一系列研究的起始，H2S是否顯著降低炎癥小體NLRP3活化之后的下游產(chǎn)物水平？H2S是通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制炎癥小體NLRP3表達(dá)的？這一系列問(wèn)題還有待后續(xù)進(jìn)一步研究，若上述問(wèn)題被解決，有望為H2S相關(guān)藥物的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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