易夢秋， 余 旻， 王 鵬

(宜昌市第一人民醫(yī)院ICU， 湖北 宜昌 443000)

目前認(rèn)為，多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的本質(zhì)是機(jī)體炎癥反應(yīng)失控所導(dǎo)致的多器官功能序貫損傷，血管內(nèi)皮襯托于血管表面，最先感應(yīng)各種理化因素的刺激，是啟動(dòng)和放大炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮包括內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)作為靶向ECM主要成分IV型膠原(collagen type IV，IV-C)的水解酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮極其重要的作用[1]；金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)為MMP-9的內(nèi)源性抑制劑，可特異性結(jié)合MMP-9催化活性中心的鋅離子，抑制MMP-9水解蛋白的活性，進(jìn)而促進(jìn)ECM的沉積并抑制其降解[2]。在全身炎癥反應(yīng)失控而導(dǎo)致MODS發(fā)生的病理生理過程中，肺臟是最容易受損的靶器官，本實(shí)驗(yàn)通過觀察MODS大鼠模型肺組織中MMP-9、TIMP-1及IV-C的表達(dá)變化，研究它們與細(xì)胞外基質(zhì)損傷之間的關(guān)系，探討MODS肺損傷的發(fā)生機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只健康成年SD大鼠(SPF級，雄性，180～200 g，No. 42010200000481)，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)，許可證號為SCXK(鄂)2011-0012。所有大鼠于代謝籠中在濕度(60±5)%、溫度(20±2)℃和12 h光照/ 12 h黑暗周期的標(biāo)準(zhǔn)條件下自由攝食和飲水，喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，禁水4 h。

2 材料

ELISA 試劑盒購自武漢博士德試劑公司；RNA提取試劑(Trizol)購自Invitrogen；PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Erase購自TaKaRa；DNA Ladder購自北京索萊寶科技有限公司；抗MMP-9、TIMP-1和IV-C抗體購自Abcam； II 抗、BSA、DAB試劑盒、DAPI染色試劑和蛋白裂解液購自谷歌生物；BCA蛋白濃度測定試劑盒和蛋白marker購自Thermo。引物由上海生物工程有限公司合成，MMP-9的上游引物序列為5’-CCACCGAGCTATCCACTCAT-3’，下游引物序列為5’-GTCCGGTTTCAGCATGTTTT-3’；TIMP-1的上游引物序列為5’-TCCCCAGAAATCATCGAGAC-3’，下游引物序列為5’-ATGGCTGAACAGGGAAACAC-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，下游引物序列為5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。

3 主要方法

3.1動(dòng)物分組與模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重后按隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法將大鼠分為假手術(shù)(sham)對照組和盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模型組，其中，CLP組又根據(jù)造模后不同時(shí)相分為 MODS 6 h組、 MODS 12 h組、 MODS 24 h組和MODS 48 h組，每組各8只。采用改良的CLP法[3]構(gòu)建MODS大鼠模型：用3%戊巴比妥鈉以30 mg/kg腹腔注射麻醉后，大鼠常規(guī)備皮消毒，沿腹中線作長約1.0 cm的手術(shù)切口，輕輕分離出盲腸，避免損傷腸系膜血管，輕輕擠壓盲腸上端的糞便，使盲腸末端充盈，分離腸系膜血管，用無菌4號絲線在距盲腸游離端約1.5 cm處結(jié)扎，并用21號無菌針頭在結(jié)扎部位與盲腸頂端的中點(diǎn)處貫通刺穿腸壁，形成盲腸漏，并擠少許糞便至腹腔，后將盲腸還納，關(guān)閉腹腔逐層縫合切口并消毒，待麻醉蘇醒后自由飲水和攝食。Sham組大鼠僅做剖腹探查術(shù)。

3.2標(biāo)本采集 取腹主動(dòng)脈血1 mL，用血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治?，?jì)算氧合指數(shù)(oxigenation index，OI)， OI=PaO2/FiO2(FiO2=0.21)，其中PaO2為動(dòng)脈氧分壓，F(xiàn)iO2為吸入氧濃度百分比；另取腹主動(dòng)脈血5 mL，室溫靜置4 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清用于血液生化及ELISA檢測相關(guān)指標(biāo)含量。采血后迅速取肺組織，分成3份：(1)按肺組織制片要求取厚5～7 mm組織，置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h后，脫水、包埋、切片，用于HE染色和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)分析；(2)切取厚2 cm的組織塊迅速用錫箔紙輕輕包住并標(biāo)記，放入液氮中保存，制備冰凍切片，用于免疫熒光(immunofluorescence，IF)分析；(3)將組織切成小塊，用1.5 mL離心管分裝并標(biāo)記，-80 ℃保存，盡早提取總RNA和蛋白質(zhì)。制片的組織盡量取材于相同部位。

3.3肝、腎和肺功能檢測 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、膽紅素(bilirubin，BIL)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的水平。同時(shí)，采用血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治?，并?jì)算分析氧合指數(shù)。

3.4病理學(xué)檢查 將肺組織浸泡在4 %多聚甲醛溶液中固定24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，做厚度4 μm的連續(xù)切片，貼于防脫載玻片，再經(jīng)60 ℃烤箱烘烤4 h后，4 ℃保存。取出行HE染色。光鏡下觀察并取圖。

3.5ELISA檢測血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、MMP-9及TIMP-1的水平 按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3.6RT-PCR檢測肺組織MMP-9及TIMP-1的mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑提取肺組織總RNA，微量核酸蛋白檢測儀測定RNA的純度和濃度。取1 μg RNA按照說明書合成cDNA，然后以25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。MMP-9的擴(kuò)增條件為： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s， 56 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次； 72 ℃ 再延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為161 bp。TIMP-1的擴(kuò)增條件為： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性45 s， 58 ℃退火35 s， 72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次； 72 ℃再延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為329 bp。β-actin的擴(kuò)增條件為： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性35 s， 59 ℃退火35 s， 72 ℃延伸35 s，循環(huán)35次； 72 ℃再延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為375 bp。取20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，最后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察取圖并分析結(jié)果。

3.7免疫組織化學(xué)法檢測肺組織MMP-9及TIMP-1的蛋白表達(dá) 取上述制備的切片脫蠟，檸檬酸鈉高壓鍋修復(fù)抗原，PBS沖洗，3%雙氧水消除過氧化物酶，PBS沖洗，5% BSA室溫封閉30 min，按適當(dāng)比例加入 I 抗(MMP-9 1∶100，TIMP-1 1∶200)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，加入II 抗(1∶100)，室溫孵育1 h，DAB顯色，流水沖洗，蘇木精染核，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)分布，隨機(jī)選取5個(gè)視野用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行平均吸光度分析。

3.8免疫熒光檢測肺組織IV-C的表達(dá) 從液氮中取出肺組織，置于恒冷箱式冰凍切片機(jī)內(nèi)平衡20 min，作厚度6 μm的冰凍切片，貼于防脫載玻片上，室溫放置30 min，丙酮固定10 min，室溫晾干。0.3 % Triton X-100溶液處理切片20 min，PBS沖洗，5 % BSA室溫封閉30 min，甩干，按適當(dāng)比例加入 I 抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，加入熒光 II 抗(1∶1 000)避光孵育1 h，PBS沖洗，DAPI避光染核10 min，PBS沖洗，抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察取圖并用Image-Pro Plus軟件分析平均吸光度。

3.9Western blot檢測肺組織IV-C蛋白的表達(dá) 采用蛋白裂解液提取肺組織總蛋白，參照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，計(jì)算50 μg蛋白的上樣體積，制樣，經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h，加適當(dāng)比例 I抗[MMP-9 (1∶1 000)、TIMP-1 (1∶500)和β-actin (1∶3 000)]，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次10 min，加適當(dāng)比例 II 抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，然后TBST洗3次，每次10 min。用吸水紙吸凈PVDF膜上的液體，滴加等比例混合的A、B顯影液，在凝膠成像系統(tǒng)下取圖并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計(jì)量資料采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，并用LSD法做多樣本均數(shù)間的兩兩比較，方差不齊時(shí)先進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠的一般情況

麻醉蘇醒后，sham組大鼠的精神、活動(dòng)、飲水及攝食量較假手術(shù)前稍減弱，6 h后逐漸恢復(fù)至術(shù)前狀態(tài)，全程無死亡。與sham組大鼠比較，各模型組大鼠復(fù)蘇延遲，精神差，反應(yīng)遲鈍，毛豎、色黃無光澤，眼鼻分泌物增多，縮背少動(dòng)，飲水及攝食量明顯減少，體重減輕，其中，12 h組和24 h組各死亡1只，48 h組死亡2只。

2 肝、腎和肺功能的改變

與sham組比較，各模型組均出現(xiàn)不同程度的肝、腎和肺功能損傷，血清中ALT、AST、BIL、SCr和BUN的水平呈進(jìn)行性升高，OI呈明顯下降趨勢(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 生化及血?dú)夥治鼋Y(jié)果

*P<0.05,**P<0.01vssham group.

3 肺組織形態(tài)學(xué)的改變

Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)無滲出；各模型組大鼠肺組織損傷嚴(yán)重，造模后6 h可見肺泡壁毛細(xì)血管充血，肺泡腔內(nèi)有大量漿液及少量紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，造模后12～24 h血管顯著擴(kuò)張伴出血，肺間質(zhì)增厚，肺泡腔內(nèi)充滿大量紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，48 h滲出減少，間質(zhì)增厚，部分肺泡腔閉陷，見圖1。

Figure 1. The pathologic changes of the lung tissues in control group and MODS model groups (×400). A: sham group; B: MODS 6 h group; C: MODS 12 h group; D: MODS 24 h group; E: MODS 48 h group.

圖1各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的變化

4 ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1β、MMP-9及TIMP-1的水平

與sham組比較，各模型組血清中TNF-α、IL-1β、MMP-9及TIMP-1的含量均明顯升高，于造模后12～24 h達(dá)高峰(P<0.01)，48 h有所降低，但仍高于sham組(P<0.05或P<0.01)；MODS 6 h和12 h組MMP-9/TIMP-1比值明顯高于sham組(P<0.05或P<0.01)，而24 h和48 h組MMP-9/TIMP-1比值明顯低于sham組(P<0.05或P<0.01)，見圖2、表2。

Figure 2. The serum levels of TNF-α, IL-1β, MMP-9 and TIMP-1 in control group and MODS model groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssham group.

圖2各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、MMP-9及TIMP-1水平的變化

5 RT-PCR檢測肺組織MMP-9及TIMP-1的mRNA表達(dá)

與sham組比較，各模型組肺組織MMP-9及TIMP-1的mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05或P<0.01)，于造模后12～24 h達(dá)高峰(P<0.01)，48 h有所下降，但仍高于sham組(P<0.05或P<0.01)，見圖3、表3。

6 IHC檢測肺組織MMP-9及TIMP-1蛋白的表達(dá)

與sham組比較，各模型組肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，于造模后12～24 h達(dá)高峰(P<0.01)，48 h有所下降，但仍高于sham組(P<0.01)，見圖4、5及表3。

表2 各組大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、MMP-9和TIMP-1含量及MMP-9/TIMP-1比值

*P<0.05,**P<0.01vssham group.

Figure 3. The results of RT-PCR for detecting the mRNA expression of MMP-9 and TIMP-1 in control group and MODS model groups. 1: sham group; 2: MODS 6 h group; 3: MODS 12 h group; 4: MODS 24 h group; 5: MODS 48 h group.

圖3各組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1的mRNA表達(dá)

表3 各組大鼠肺組織MMP-9及TIMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化

*P<0.05,**P<0.01vssham group.

7 IF檢測肺組織IV-C的陽性表達(dá)

與sham組比較，造模后6 h肺組織IV-C降低不明顯，12～48 h肺組織IV-C表達(dá)量下降(P<0.05)，于造模后24 h降至最低(P<0.01)，48 h有所升高，但仍低于sham組(P<0.05)，見圖6、表4。

8 Western blot檢測肺組織IV-C蛋白的表達(dá)

與sham組比較，造模后6 h肺組織IV-C降低不明顯，12～48 h肺組織IV-C蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，于造模后24 h降至最低(P<0.01)，48 h有所升高，但仍低于sham組(P<0.01)，見圖7、表4。

討 論

MODS是一種由多種病因引起的臨床表現(xiàn)復(fù)雜、治療難度大且死亡率極高的臨床綜合征，常并發(fā)于重癥感染、胰腺炎及心肺復(fù)蘇等重大打擊后，是危重病醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。MODS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，確切機(jī)制至今尚未完全闡明，主要有缺血再灌注損傷假說、內(nèi)毒素假說、胃腸道假說、炎癥失控假說、二次打擊學(xué)說和炎癥失衡學(xué)說等等[4-5]。然而，無論是何種機(jī)制導(dǎo)致的MODS發(fā)生，持續(xù)失控的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙是MODS的“必經(jīng)之路”。目前國內(nèi)外學(xué)者對內(nèi)皮細(xì)胞損傷學(xué)說研究較多，認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞的激活和損傷可啟動(dòng)并放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)凝血過程，強(qiáng)化免疫細(xì)胞的相互作用，最終導(dǎo)致微循環(huán)閉塞，引起組織低灌注及缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致器官功能的損害[6-8]。血管內(nèi)皮包括內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，而ECM作為血管內(nèi)皮的重要組成部分是炎癥反應(yīng)的靶器官之一，如能證明ECM的損傷也參與MODS的發(fā)生與發(fā)展，將完善MODS的發(fā)病機(jī)制，為臨床上MODS的防治提供新的思路。

Figure 4. Comparison of lung tissue MMP-9 positive staining in control group and MODS model groups (×400). A: sham group; B: MODS 6 h group; C: MODS 12 h group; D: MODS 24 h group; E: MODS 48 h group.

圖4各組大鼠肺組織MMP-9陽性表達(dá)的變化

Figure 5. Comparison of lung tissue TIMP-1 positive staining in control group and MODS model groups (×400). A: sham group; B: MODS 6 h group; C: MODS 12 h group; D: MODS 24 h group; E: MODS 48 h group.

圖5各組大鼠肺組織TIMP-1陽性表達(dá)變化

Figure 6. Comparison of lung tissue IV-C positive staining in control group and MODS model groups (×400). A: sham group; B: MODS 6 h group; C: MODS 12 h group; D: MODS 24 h group; E: MODS 48 h group.

圖6各組大鼠肺組織IV-C陽性表達(dá)變化

Figure 7. The protein expression of IV-C in the lung tissues of the rats with MODS for different times determined by Western blot.

圖7各組大鼠肺組織IV-C蛋白表達(dá)的變化

表4各組大鼠肺組織IV-C的蛋白表達(dá)水平比較

Table 4. The protein expression of IV-C in the lung tissues of each group determined by immunofluorescence and Western blot (Mean±SD.n=3)

GroupIFWestesrnblotSham0.28±0.072.25±0.13MODS6h0.25±0.061.93±0.11MODS12h0.17±0.05*1.22±0.19*MODS24h0.14±0.05**0.53±0.13**MODS48h0.17±0.03*0.80±0.18**

*P<0.05,**P<0.01vssham group.

MMPs家族是自然界中高度保守的一類酶，幾乎能降解ECM的所有成分，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)26種，它們由酶原激活，主要受基因轉(zhuǎn)錄、酶原活化和抑制劑抑制3個(gè)水平上的調(diào)控，參與組織損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[9]。MMP-9與MMPs家族的其它成員一樣，是鋅離子依賴性蛋白水解酶，具有廣泛的底物特異性，它主要以明膠和IV-C為底物，因此又稱明膠酶或IV-C酶。MMP-9在正常組織中極少表達(dá)，當(dāng)機(jī)體遭受嚴(yán)重感染等打擊后，細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素結(jié)合細(xì)胞表面的特異性蛋白形成復(fù)合物，激活單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，合成并釋放大量的炎癥介質(zhì)如TNF-ɑ、IL-1β和IL-6等，從而上調(diào)MMP-9的表達(dá)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用CLP法建立MODS大鼠模型，造模后各項(xiàng)生化、血?dú)饧把装Y指標(biāo)的改變都提示模型組大鼠發(fā)生明顯的多器官功能損害。本實(shí)驗(yàn)著重研究MODS時(shí)的肺損傷情況，肺組織形態(tài)學(xué)改變也顯示模型組大鼠肺損傷較重。MMP-9的水平可以反映肺基底膜膠原蛋白尤其是IV-C的代謝情況，隨著膠原蛋白合成增加和降解減少，血清中MMP-9的水平會(huì)相應(yīng)升高或降低。在本研究中，模型組血清及肺組織中MMP-9的表達(dá)均明顯高于對照組，提示在MODS肺損傷早期存在IV-C代謝異常。肺是炎癥介質(zhì)的靶器官之一，在各種炎癥介質(zhì)損傷血管內(nèi)皮的過程中，伴隨著細(xì)胞外骨架蛋白IV-C的破壞，從而影響肺組織的結(jié)構(gòu)及功能[12]。本實(shí)驗(yàn)中各模型組肺組織IV-C的含量隨著病情進(jìn)展呈下降趨勢，造模后6 h IV-C的改變不顯著，12～48 h可見其明顯下降，且于24 h降至最低，48 h有所升高，但仍低于對照組。我們考慮，在肺損傷早期基質(zhì)破壞而機(jī)體來不及代償，隨著病情加重機(jī)體防御性修復(fù)機(jī)制使細(xì)胞合成IV-C增加，降解減少，這可能是48 h組肺組織IV-C回升的因素之一。

TIMP-1為MMP-9的內(nèi)源性抑制劑，常由分泌MMP-9的同一細(xì)胞合成。研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1不僅可抑制MMP-9酶原活化并使已活化的MMP-9失活，它還作為一種轉(zhuǎn)錄抑制劑通過抑制MMPs基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基質(zhì)成分合成和降解失衡，引起組織結(jié)構(gòu)重塑[13]。本實(shí)驗(yàn)中，各模型組血清及肺組織中TIMP-1的表達(dá)均明顯升高，在造模后24 h達(dá)高峰，48 h有所下降，但仍高于對照組。提示在MODS肺損傷早期，不僅存在MMP-9的高表達(dá)，TIMP-1的升高也可能在MODS發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，TIMP-1與MMP-9可共同作為MODS早期診斷和預(yù)測預(yù)后的良好指標(biāo)。

綜上所述，我們推測炎癥反應(yīng)可通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)中MMP-9的過表達(dá)而放大血管內(nèi)皮中的炎癥反應(yīng)，加重血管內(nèi)皮損傷，造成組織低灌注和缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致MODS發(fā)生；MODS條件下TIMP-1應(yīng)激性表達(dá)上調(diào)可能通過抑制MMP-9的活性而減輕MODS的嚴(yán)重程度。靶向抑制血管內(nèi)皮中MMP-9活性或上調(diào)TIMP-1水平可能成為新的MODS有效治療途徑。

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