易元月， 劉 寶， 官立彬， 高鈺琪

(第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系高原特需藥品與衛(wèi)生裝備研究室，高原環(huán)境醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，全軍高原醫(yī)學(xué)重點實驗室， 重慶 400038)

高原紅細(xì)胞增多癥(high-altitude polycythemia，HAPC)是久居高原人群中最常見的慢性高原病，其本質(zhì)是在長期低氧作用下紅細(xì)胞過度增多，導(dǎo)致血液黏滯度增大和微循環(huán)障礙，加重組織和細(xì)胞缺氧，引起頭痛、頭暈、氣促、胸悶和乏力等癥狀，病情嚴(yán)重者甚至喪失勞動能力及生活能力[1-6]。由于對HAPC的發(fā)生機制認(rèn)識尚不完全清楚，目前臨床上尚缺乏對HAPC的有效防治措施。研究結(jié)果顯示，高原缺氧可顯著上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的表達(dá)，刺激肝、腎等器官大量分泌促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)，其與骨髓等造血器官的EPO受體結(jié)合后可上調(diào)膜蛋白、細(xì)胞骨架及血紅蛋白(hemoglobin，Hb)等的表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓紅系增生增加，導(dǎo)致血液中紅細(xì)胞的數(shù)量增多[7]。以往關(guān)于HAPC病理生理機制的研究大多在于探討缺氧如何引起紅細(xì)胞過度增生，而對于過度增多的紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的改變關(guān)注不多[8]。為此，本研究建立連續(xù)低壓缺氧動物模型，觀察研究缺氧暴露不同時間后紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的改變，期望為深入揭示HAPC的病理生理學(xué)機制及防治提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 儀器與試劑

低壓缺氧模擬艙(貴州風(fēng)雷航空機械制造公司)；全自動血液分析儀(XT-2000i，Sysmex)；全自動血流變檢測儀(SH-212D，中國重慶賽航科技發(fā)展有限公司)；HEMOX-ANALYZER血氧分析儀(TCS Scientific)；BD FACS Verse流式細(xì)胞儀(BD)。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)等。

2 方法

2.1實驗動物與分組 40只雄性SD大鼠(8周齡，體重200～220 g)由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0005和SCXK(渝)2012-0010。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分成5組：常氧(normal control，C)組、缺氧1周(1-week hypoxia，H1)組、缺氧2周(2-week hypoxia，H2)組、缺氧3周(3-week hypoxia，H3)組和缺氧4周(4-week hypoxia，H4)組，每組各8只。

2.2低壓艙模擬5 800 m高原慢性缺氧大鼠模型的建立 常氧組大鼠置于常氧環(huán)境下飼養(yǎng)。各缺氧組大鼠置于模擬海拔5 800 m的低壓艙內(nèi)，持續(xù)不間斷缺氧暴露，分別于缺氧暴露1、2、3及4周時以14%氨基甲酸乙酯(10 mg/kg)麻醉大鼠，取材并檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.3血常規(guī)檢測 收集腹主動脈全血，EDTA-K2抗凝，用全自動血液分析儀測定紅細(xì)胞計數(shù)值(red blood cell count，RBC)、血紅蛋白含量(Hb)、平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume，MCV)和平均血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)等指標(biāo)。

2.4紅細(xì)胞變形指數(shù)檢測 收集腹主動脈全血，肝素鈉抗凝，用全自動血流變檢測儀測定紅細(xì)胞變形指數(shù)。

2.5紅細(xì)胞滲透脆性觀察 收集腹主動脈全血，肝素鈉抗凝，依次滴入不同濃度梯度的氯化鈉溶液中，靜置30 min，觀察并記錄紅細(xì)胞開始發(fā)生溶血時的鹽水濃度。

2.6血紅蛋白氧解離曲線檢測 收集腹主動脈全血，以EDTA-K2抗凝，用HEMOX-ANALYZER血氧分析儀測定血紅蛋白氧飽和度為50%時對應(yīng)的血氧分壓(oxygen half-saturation of hemoglobin，P50)，并繪制血紅蛋白氧解離曲線。

2.7紅細(xì)胞凋亡率檢測 收集腹腔動脈全血，肝素鈉抗凝，離心，去除白細(xì)胞和血漿，于紅細(xì)胞沉淀中加入Annexin V-FITC結(jié)合液及Annexin V-FITC染液，用流式細(xì)胞分析儀檢測凋亡紅細(xì)胞的百分比，即磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻陽性率。

2.8骨髓病理切片 取大鼠股骨， 4%多聚甲醛固定，脫鈣，石蠟包埋、切片，行HE染色觀察。另取切片，分別以抗α-血紅蛋白穩(wěn)定蛋白(α-hemoglobin-stabilizing protein，AHSP)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，CD71)抗體為 I 抗、抗SP抗體為 II 抗行免疫組化觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血常規(guī)

與C組相比，各缺氧組RBC均顯著增加(P<0.01)；分別與H1、H2和H3組相比，H4組RBC顯著增加(P<0.01)，見圖1。

與C組相比，各缺氧組Hb均顯著增加(P<0.01)；與H1組相比，H2、H3和H4組Hb均顯著增加(P<0.05)；分別與H2和H3組相比，H4組Hb顯著增加(P<0.05)，見圖1。

與C組相比，各缺氧組MCV均顯著增加(P<0.01)；各缺氧組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。

與C組相比，各缺氧組MCH均顯著增加(P<0.01)；與H1組相比，H3組MCH顯著增加(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The changes of RBC, Hb, MCV and MCH of rats in the 5 groups. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsC group;#P<0.05，##P<0.01vsH1 group;△△P<0.01vsH2 group;§§P<0.01vsH3 group.

圖1各組大鼠RBC、Hb、MCV和MCH的變化情況

2 紅細(xì)胞變形指數(shù)

與C組相比，各缺氧組紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低(P<0.01)；與H1組相比， H2和H4組變形指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與H2組相比，H3組變形指數(shù)顯著增加(P<0.01)；與H3組相比，H4組變形指數(shù)顯著降低(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The changes of erythrocyte deformation index of rats in the 5 groups. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsC group;#P<0.05vsH1 group;△△P<0.01vsH2 group;§§P<0.01vsH3 group.

圖2各組大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)的變化情況

3 紅細(xì)胞滲透脆性

與C組相比，H1、H3和H4組紅細(xì)胞滲透脆性顯著降低(P<0.01)；與H1組相比，H2組滲透脆性顯著增加(P<0.01)；與H2組相比，H3和H4組滲透脆性顯著降低(P<0.05，P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The changes of erythrocyte osmotic fragility of rats in the 5 groups. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsH1 group;△P<0.05,△△P<0.01vsH2 group.

圖3各組大鼠紅細(xì)胞滲透脆性的變化情況

4 血紅蛋白氧解離曲線

與C組相比，各缺氧組的P50顯著增加(P<0.05)，見圖4。

與C組相比，H3組的希爾系數(shù)(Hill coeffcient，HC)顯著增加(P<0.01)； 與H1和H2組相比，H3組的HC均顯著增加(P<0.01)；與H3組相比，H4組的HC顯著降低(P<0.01)，見圖4。

與C組相比，各缺氧組的氧離曲線均發(fā)生右移，見圖4。

Figure 4. The changes of P50, Hill coefficient (HC) and oxygen dissociation curves of rats in the 5 groups. PO2： partial pressure of oxygen； SO2： oxygen saturation of hemoglobin. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsC group;##P<0.01vsH1 group;△△P<0.01vsH2 group;§§P<0.01vsH3 group.

圖4各組大鼠血紅蛋白P50、希爾系數(shù)和氧解離曲線的變化情況

5 紅細(xì)胞凋亡

與C組相比，H2和H4組紅細(xì)胞膜上PS外翻率顯著增加(P<0.01)；與H1組相比，H2和H4組PS外翻率也顯著增加(P<0.01)；與H2組相比，H3組PS外翻率顯著降低(P<0.01)；與H3組相比，H4組PS外翻率顯著增加(P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The changes of PS externalization on erythrocytes of rats in the 5 groups. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsH1 group;△△P<0.01vsH2 group;§§P<0.01vsH3 group.

圖5各組大鼠紅細(xì)胞膜上PS外翻率的變化情況

6 骨髓病理切片觀察

HE染色可見，與C組相比，各缺氧組骨髓中紅系細(xì)胞數(shù)量增多，見圖6A～E；免疫組化染色觀察可見，與C組相比，各缺氧組骨髓紅系前體細(xì)胞數(shù)量增多，見圖6F～O。

討 論

模擬高原缺氧環(huán)境，大氣氧分壓下降導(dǎo)致吸入氣氧分壓降低和動脈血氧分壓下降。為適應(yīng)高原低氧環(huán)境，機體會發(fā)生一系列代償適應(yīng)性反應(yīng)，其中包括血液系統(tǒng)的反應(yīng)。紅細(xì)胞增多有利于增加血液對氧的運輸能力，是對高原低氧的重要的代償適應(yīng)機制。但紅細(xì)胞過度增多，則可引起血液的流動速度減慢，嚴(yán)重的紅細(xì)胞增多可加重組織和細(xì)胞的缺氧，引起個體微循環(huán)障礙，易導(dǎo)致多器官缺血缺氧性疾病的發(fā)生，受累較嚴(yán)重的器官為腦、心、肺及肝。臨床表現(xiàn)有血栓形成、血管卒中或局部組織壞死等，嚴(yán)重者甚至發(fā)生猝死[9-10]。除了返回富氧環(huán)境之外，尚無任何有效的干預(yù)方法[11]。

已有大量對HAPC機制的研究指出，在高原缺氧情況下，HIF-1α與HIF-1β結(jié)合后活化成有轉(zhuǎn)錄活性的HIF-1，調(diào)控EPO和促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)的基因編碼；同時調(diào)控二價金屬離子轉(zhuǎn)運體(divalent metal-ion transporter-1，DMT1)、鐵調(diào)素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及受體，以上所有蛋白調(diào)控機體對鐵的利用，使鐵利用增加，紅細(xì)胞生成增多[10]。也有研究報道，在高原缺氧時，HIF-2α通過對GATA結(jié)合蛋白1(GATA binding protein-1，GATA-1)的表達(dá)調(diào)控來促進(jìn)肺泡Ⅱ型細(xì)胞中血紅蛋白的表達(dá)，HIF-2α可能參與了HAPC成熟紅細(xì)胞的過度增生過程[12]。但研究者們對缺氧暴露過程中紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變認(rèn)識仍不夠。2014年，Li等[13]的文章報道了采用不連續(xù)間斷模擬高原缺氧暴露制備大鼠HAPC模型的方法，主要結(jié)果是大鼠每天暴露于模擬海拔5 500 m高原8 d、2周、4周及12周，可以引起紅細(xì)胞數(shù)量顯著增加，血紅蛋白濃度升高，紅細(xì)胞壓積增加，全血黏度增加及紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高。雖然，Li 等[13]的結(jié)果顯示間斷性缺氧(8 h/d)可以引起紅細(xì)胞數(shù)量增多，但大量研究顯示，在間斷性缺氧暴露過程中，機體實際是經(jīng)歷缺氧-富氧的反復(fù)交替刺激，所導(dǎo)致的生理、病理生理學(xué)改變及機制與連續(xù)暴露于缺氧環(huán)境完全不同。為此，本文采用模擬高原連續(xù)暴露動物模型，更加接近久居高原人群的實際，研究結(jié)果更加有助于豐富對HAPC的認(rèn)識。此外，本文的重點在于利用更加符合高原實際的動物模型觀察連續(xù)高原缺氧暴露對紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響，為全面深入認(rèn)識高原紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

Figure 6. The changes of bone marrow biopsy of rats in the 5 groups (×800).

圖6各組大鼠骨髓病理切片的變化情況

本次實驗結(jié)果顯示， 與C組比較，各缺氧組RBC、HB、MCV、MCH及PS外翻率顯著增加，紅細(xì)胞變形指數(shù)及滲透脆性顯著降低，P50顯著增大，血紅蛋白氧離曲線右移，骨髓紅系增生增加。查閱文獻(xiàn)可知，MCV增大的原因可能是缺氧組大鼠血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目增多所導(dǎo)致的[14]。MCH增大提示缺氧組血紅蛋白攜氧能力增強[15]。由于發(fā)生凋亡的紅細(xì)胞膜上PS外翻，因此可用PS外翻率反映紅細(xì)胞凋亡率[16-18]。紅細(xì)胞變形性降低的原因是高原缺氧時紅細(xì)胞膜上的膽固醇/磷脂比值下降，引起紅細(xì)胞膜流動性降低，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形性降低[19-20]。紅細(xì)胞滲透脆性降低可能與紅細(xì)胞的厚徑和膜穩(wěn)定性的變化有關(guān)系[21]。滲透脆性越低，紅細(xì)胞越不易溶血[22-23]。紅細(xì)胞滲透脆性及變形性降低，推測缺氧組不易通過毛細(xì)血管的紅細(xì)胞也不易發(fā)生溶血反應(yīng)，因此毛細(xì)血管內(nèi)可能會滯留過多變形性降低的紅細(xì)胞。P50升高時，血紅蛋白與氧的親和力下降，氧解離曲線右移，血紅蛋白釋氧功能增強[23-25]。此外，本研究結(jié)果顯示，與C組相比，H3組希爾系數(shù)顯著增加，提示H3組4個亞基間正協(xié)同效應(yīng)最強，當(dāng)HC>1時表示血紅蛋白與氧分子正協(xié)同，即血紅蛋白1個亞基與氧分子結(jié)合后，其余亞基更容易與氧分子結(jié)合[26]。慢性缺氧時，腎臟釋放EPO增多，引起骨髓造血祖細(xì)胞向紅系分化增多，促進(jìn)紅細(xì)胞成熟以及血紅蛋白的合成[26]。AHSP是一種特異性的紅系伴侶蛋白，這種蛋白可以促進(jìn)新生的α珠蛋白并入血紅蛋白中，它是紅系細(xì)胞的潛在特異性標(biāo)示物的代表[27]。AHSP在細(xì)胞分化過程中表達(dá)水平會增加，在血紅蛋白生成增多時AHSP高表達(dá)；當(dāng)紅系前體細(xì)胞丟失其細(xì)胞核功能或血紅蛋白合成減少時AHSP低表達(dá)。CD71是已確定的紅系標(biāo)志物，可以上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物并且可在紅系前體細(xì)胞表面高表達(dá)[27-28]。因此，AHSP與CD71均高表達(dá)的骨髓前體細(xì)胞增多表明缺氧組骨髓紅系增生增加。

綜上所述，在模擬高原缺氧初期，外周血中紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變從而使血紅蛋白攜氧和釋氧能力增強以增加機體對組織的氧氣供應(yīng)量，利于高原習(xí)服；但是，隨著缺氧時間的延長，血管內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)目異常增多，血液黏滯度過度增加，容易導(dǎo)致血栓形成及微循環(huán)障礙并加重機體的組織細(xì)胞缺氧。上述結(jié)果為深入揭示HAPC 的發(fā)生機制和防治提供了實驗依據(jù)。

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