余東林，楊 希，陰佳瀅，劉雪會(huì)，呂 湘

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病理生理學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

紅細(xì)胞是血液中含量極其豐富的細(xì)胞類型，具有攜氧能力，對(duì)于維持生命至關(guān)重要。紅系終末分化是產(chǎn)生成熟紅細(xì)胞的前置步驟，依次經(jīng)歷原幼紅(proerythroblast，ProE)、早幼紅(basophilic erythro-blast，BasoE)、中幼紅(polychromatophilic erythro-blast，PolyE)、晚幼紅(orthochromatic erythroblast，OrthoE) 細(xì)胞階段，經(jīng)脫核產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞，進(jìn)一步在血循環(huán)中形成成熟紅細(xì)胞[1]。紅系相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于促進(jìn)紅系終末分化成熟具有重要作用，如KLF1、FOXO3、E2F2、NFE2等，其表達(dá)異常或缺失導(dǎo)致紅系終末分化受阻或抑制脫核引發(fā)貧血[2-4]。因此篩選紅系終末分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有助于尋找貧血的治療靶點(diǎn)。

利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜可精確刻畫細(xì)胞分化軌跡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近期發(fā)表的人與小鼠的紅系單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜可幫助揭示紅系終末分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[5]。SCENIC(single-cell regulatory network inference and clustering)分析是目前較為公認(rèn)的分析轉(zhuǎn)錄因子的方法[6]，優(yōu)勢(shì)在于在轉(zhuǎn)錄因子和靶點(diǎn)基因共表達(dá)分析的基礎(chǔ)上結(jié)合Motif富集分析，從而更加可靠地預(yù)測(cè)出轉(zhuǎn)錄因子主導(dǎo)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

本研究對(duì)人紅系終末分化的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SCENIC分析，并對(duì)預(yù)測(cè)所得的核轉(zhuǎn)錄因子NFYB和NFYC進(jìn)行驗(yàn)證，初步探究其在紅系終末分化中的表達(dá)模式及調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)基IMDM、DMEM、胎牛血清和HEPES(Gibco公司)；實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒由暨南大學(xué)鞠振宇實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；T4 DNA連接酶及T4 DNA連接酶緩沖液(BioLabs公司)；感受態(tài)細(xì)胞DH5α(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；C57BL/6 小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；EcoRⅠ/XhoⅠ內(nèi)切酶(NEB 公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；膠回收試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；轉(zhuǎn)染試劑p4000(北京蘭博利德商貿(mào)有限公司)； TER119磁珠(Miltenyi公司)；TER119-PE抗體、CD71-APC抗體和FcR 封閉抗體(BD公司)；Hoechst 33342和F-108(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒：借助網(wǎng)站(http://splashrna.mskcc.org/)設(shè)計(jì)Nfyb和Nfyc的shRNA序列各3條，shLuc：5′-TTAATCAGAGACTTCAGGCGGT-3′，shNfyb-1：5′-TTTTGAACCATTTGTATCTTCA-3′，shNfyb-2：5′-TCTTCATGATCATTCATGCTGT-3′，shNfyb-3：5′-TCA CATAATGACTTCCTCCGAT-3′，shNfyc-1：5′-TTCA TAATCTTCTTAATACGAG-3′，shNfyc-2：5′-TAATCT TCTTAATACGAGCCAG-3′，shNfyc-3：5′-TTTCATA ATCTTCTTAATACGA-3′。合成相應(yīng)序列后退火合成雙鏈DNA，與酶切后的SFFV-GFP-miR30 載體質(zhì)粒連接，測(cè)序驗(yàn)證插入序列的準(zhǔn)確性。

1.2.2 包裝病毒：將HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。加入轉(zhuǎn)染試劑P4000、病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G和相應(yīng)的干擾質(zhì)粒后48、72 h分別收集培養(yǎng)基，過濾后超高速離心得到病毒沉淀，用胎肝增殖培養(yǎng)基重懸保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 小鼠胎肝細(xì)胞體外紅系分化: 取小鼠E14.5的胎肝，使用1 mL注射器將肝臟吹成單細(xì)胞懸液，磁珠分選獲得TER119陰性細(xì)胞，增殖培養(yǎng)3 d，分化培養(yǎng)3 d[7]。

1.2.4 感染病毒：在體外培養(yǎng)的小鼠胎肝細(xì)胞增殖期第1天向細(xì)胞中加入F-108和HEPES，顛倒混勻后分孔，分別加入相應(yīng)的慢病毒，24 h后換液。

1.2.5 熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)分選與檢測(cè)：小鼠胎肝TER119陰性細(xì)胞體外誘導(dǎo)紅系分化3 d，取1×107個(gè)細(xì)胞加入0.5 μL FcR抗體封閉，4 ℃ 15 min，加入TER119-PE 1 μL和CD71-APC(稀釋5倍)1 μL，4 ℃ 30 min。使用索尼MA900流式細(xì)胞分選儀收集紅系終末分化各個(gè)時(shí)期的(R2～R5)細(xì)胞。對(duì)基因干擾和對(duì)照組細(xì)胞，在上述抗體孵育后繼續(xù)加入Hoechst進(jìn)行核染色，使用MA900檢測(cè)紅系分化效果和脫核率，F(xiàn)lowJo軟件分析結(jié)果。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)mRNA： 使用Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進(jìn)行qPCR檢測(cè)。Nfyb：正向引物5′-GCCTCCCAGCTAGGGATTTC-3′，反向引物5′-TTCCTGTTTGAGGTATGGCATTT-3′。 Nfyc：正向引物5′- TGAAACCTCCAAAGCGCCA-3′，反向引物5′- GTGGTCTGACCCTGCTGAG-3′。 Actin：正向引物5′-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAATC-3′，反向引物5′-AGCACTGTGTTGGCATAGAGGT-3′。 Hbb：正向引物5′-CCAGCCTCAGTGAGCTCCACT-3′，反向引物5′- GGCCCAGCACAATCACGAT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4 生物信息分析

1.4.1 Bulk轉(zhuǎn)錄組分析：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載人類和小鼠的紅系終末分化各個(gè)時(shí)期的bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集(GSE53983)，使用cutadapt和trimmomatic軟件去除接頭和低質(zhì)量序列，通過hisat2軟件分別比對(duì)到人類基因組hg19和小鼠基因組mm10，得到sam文件，并使用samtools軟件壓縮為bam文件，使用featureCounts軟件得到基因表達(dá)矩陣，最后使用R軟件進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)集(GSE150774)，使用Seurat包分別處理3個(gè)人類骨髓細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)矩陣，經(jīng)過無監(jiān)督細(xì)胞聚類，歸一化，降維分析等處理后合并。使用rSuperCT包預(yù)測(cè)細(xì)胞類型，只保留紅細(xì)胞，并使用DoubletFinder包去除doublet，最終保留9 277個(gè)細(xì)胞用于后續(xù)的分析。使用monocle3包進(jìn)行擬時(shí)序分析，從而確定分化的時(shí)序關(guān)系。

1.4.3 SCENIC分析： 使用SCENIC包用于預(yù)測(cè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GENIE3包分析轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的共表達(dá)情況；RcisTarget包進(jìn)行Motif分析，將不具有共同Motif的靶基因刪除，留下的靶基因與轉(zhuǎn)錄因子作為一個(gè)調(diào)節(jié)單元，即regulon；AUCell包計(jì)算每個(gè)regulon在每個(gè)細(xì)胞的活性打分。

1.4.4 代碼可用性：代碼已經(jīng)上傳于GitHub(https://github.com/yudonglin506311858/nfyb_project)。

2 結(jié)果

2.1 人骨髓紅系細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜分析提示NFYB及NFYC因子參與紅系終末分化調(diào)控

利用人類骨髓紅系終末分化細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集(GSE150774)[8]，使用Seurat包和monocle3包進(jìn)行分析，確定分化階段ProE/BasoE、 Early-PolyE、 Late-PolyE、 Early-OrthoE和 Late-OrthoE(圖1A～B)。使用SCENIC預(yù)測(cè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)單元(regulon)[6]。根據(jù)regulon在每個(gè)細(xì)胞亞群的特異性分?jǐn)?shù)進(jìn)行排序(圖1C～D)，NFY轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的兩個(gè)亞基NFYB和NFYC均被預(yù)測(cè)為紅系終末分化早期的調(diào)控因子且特異性較高，其regulon活性和RNA表達(dá)水平在紅系分化較早期的ProE/BasoE和 Early-PolyE中最高(圖1E～F)。

2.2 Nfyb和Nfyc在人和小鼠紅系終末分化不同時(shí)期的表達(dá)情況

進(jìn)一步利用bulk轉(zhuǎn)錄組[9]分析Nfyb和Nfyc在紅系終末分化各個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況。人骨髓細(xì)胞紅系終末分化早期高表達(dá)NFYB和NFYC(圖2A)，進(jìn)入OrthoE后顯著下降；而在小鼠骨髓紅系細(xì)胞的表達(dá)模式稍有不同(圖2B)，Nfyb在PolyE時(shí)期有更高的表達(dá)，Nfyc則在OrthoE表達(dá)顯著降低。對(duì)小鼠胎肝細(xì)胞進(jìn)行體外紅系誘導(dǎo)分化,可通過CD71與TER119信號(hào)強(qiáng)度將細(xì)胞分為R1-R5的5個(gè)漸次成熟的細(xì)胞群(圖2C)，Nfyb和Nfyc在終末分化較早期的R3-R4表達(dá)上調(diào)，隨后表達(dá)下降(圖2D)，與小鼠骨髓的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表現(xiàn)一致。

2.3 敲低Nfyb和Nfyc抑制血紅蛋白基因的表達(dá)

利用小鼠胎肝體外紅系分化體系進(jìn)行Nfyb和Nfyc的功能研究。兩個(gè)基因各3條特異性shRNA序列均可在RNA水平顯著降低Nfyb或Nfyc的表達(dá)(圖3A～B)。進(jìn)一步通過qPCR技術(shù)檢測(cè)紅系終末關(guān)鍵的血紅蛋白Hbb基因表達(dá)，靶向兩個(gè)基因的3條shRNA序列均可顯著下調(diào)Hbb的RNA表達(dá)水平，提示抑制Nfyb和Nfyc可影響紅系終末分化(圖3C～D)。

A.UMAP projection of human terminal erythropoiesis, cell types colored by different colors; B.pseudo-time analysis; C,D.regulon specificity score of different regulons in “ProE/BasoE” and “Early-PolyE” cells; E,F.activation (left) and expression (right) of NFYB (E) and NFYC (F) were indicated by red color

2.4 敲低Nfyb和Nfyc抑制紅系終末分化及脫核

敲低Nfyb和Nfyc后，流式細(xì)胞分析顯示紅系分化較早期R3和R4比例增加，晚期R5比例顯著下降(圖4A～B)，且紅細(xì)胞脫核率顯著降低(圖4A,C)，說明抑制Nfyb和Nfyc使紅系終末分化阻滯在較早期。

3 討論

本研究主要基于紅系終末分化單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子預(yù)測(cè)，并結(jié)合bulk轉(zhuǎn)錄組和功能實(shí)驗(yàn)初步探究了轉(zhuǎn)錄因子NFYB和NFYC在紅系終末分化中的表達(dá)及作用。結(jié)果表明NFYB和NFYC在人與小鼠紅系終末分化較早期的BasoE和PolyE高表達(dá)，分別敲低后使紅系終末分化阻滯在早期，表明NFYB和NFYC是紅系終末分化早期的調(diào)控因子。

A,B.expression levels of NFYB and NFYC in human (A) and mouse (B) terminal erythropoiesis were identified in published bulk transcriptional sequencing data(GSE53983); C.flowchart of mouse fetal liver in vitro erythroid differentiation and the soring of cells at different maturation stages (R1-R5) by flow cytometry；D.expression levels of NFYB and NFYC at different stages of terminal erythroid differentiation of mouse fetal liver; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with ProE or R2

A,B.knockdown efficiency of Nfyb and Nfyc；C,D.RT-qPCR detection of hemoglobin gene (Hbb) expression level;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with shLuc group

A.representative flow cytometry plots showing the effects of Nfyb and Nfyc knockdown on erythroid differentiation and enucleation; B.knockdown of Nfyb and Nfyc blocked erythroid terminal differentiation; C.knockdown of Nfyb and Nfyc decreased enucleation rate; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with shLuc group

NF-Y復(fù)合物由NFYA、NFYB和NFYC組成，其中NFYA識(shí)別啟動(dòng)子中CCAAT 框的序列，NFYB和NFYC形成類核小體結(jié)構(gòu)[10]，招募 TATA 盒結(jié)合蛋白(TBP)和RNA聚合酶II到啟動(dòng)子[11]。NF-Y通過直接結(jié)合CCAAT 框激活γ-珠蛋白[12]，參與珠蛋白的轉(zhuǎn)錄[13]。此外，NF-Y是造血干細(xì)胞增殖和存活所必需的[14]，還具有調(diào)節(jié)線粒體活性的功能[15]。關(guān)于NF-Y在紅系終末分化中調(diào)控的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。