楊 旻， 曹新冉， 王園園， 王曉瓊， 于詩然， 董 波△， 高 靖

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟南 250014； 2山東省立醫(yī)院心內(nèi)科， 山東 濟南 250021； 3山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科， 山東 濟南 250001)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，其主要病變是心肌纖維化、左室重構(gòu)及心功能不全，最終進展為心力衰竭，嚴重者危及生命。多項研究發(fā)現(xiàn)， 在糖尿病心肌病的發(fā)展過程中，心肌組織中伴有炎癥細胞浸潤及炎癥因子的異常表達。慢性炎癥的存在可能通過誘導(dǎo)心肌纖維化和左心室僵硬進一步加劇心功能受損[1-3]。目前認為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotesin system，RAS)在糖尿病心肌病的形成和發(fā)展中起著重要作用[4]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)作為RAS的最新成員，通過水解血管緊張素(angiotensin, Ang)Ⅱ生成Ang-(1-7)對心肌起保護作用[5-6]。本課題組前期研究表明，ACE2過表達能夠改善糖尿病性心肌病大鼠的左室重塑和心功能[7]。 最近美國食品藥物管理局列出抗錐蟲毒素的小分子重氮氨苯脒乙酰甘氨酸鹽(diminazene aceturate，DIZE)具有內(nèi)源性激活A(yù)CE2的作用。DIZE作為ACE2的內(nèi)源性激動劑，提高了ACE2的活性，通過ACE2—Ang-(1-7)—Mas軸對機體起到保護作用[8]。目前，DIZE已被用于多種疾病的研究，但對于糖尿病心肌病的研究相對較少。本研究將探討DIZE對DCM心功能及炎癥反應(yīng)的影響，從而為臨床防治DCM提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 動物

健康成年雄性Wistar 大鼠30只，體重200～220 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(魯)2014-0007。

2 主要試劑與設(shè)備

2.1主要藥品與試劑 DIZE 購自Fluka; 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma; 抗ACE2抗體購自Abcam；大鼠AngⅡ和Ang-(1-7) 檢測試劑盒購自北京冬歌偉業(yè)科技有限公司；免疫組化試劑盒和DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)購自北京索萊寶科技有限公司；Tween-20 和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天公司；血糖儀及試紙購自三諾生物傳感股份有限公司。

2.2儀器設(shè)備 石蠟包埋機(EG1150C)、烘片機(H11220)、石蠟切片機(RM2245)和自動脫水機(TP1020)為Leica產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡(BX-41，OLYMPUS)；彩色多普勒超聲儀(Sonos 7500，Philips)；化學(xué)發(fā)光儀(Amersham Imager 600，GE)；酶標儀(Thermo)。

3 主要方法

3.1DCM模型的建立 將Wistar大鼠隨機分為正常對照(normal control，N)組10只和糖尿病組20只。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，禁食12 h，糖尿病組大鼠腹腔一次性注射STZ(65 mg/kg)，正常對照組注射相同劑量的檸檬酸鹽緩沖液。72 h 后監(jiān)測大鼠血糖，以血糖>16.6 mmol/L 為糖尿病模型動物。普通飼料喂養(yǎng)12 周后，正常組死亡1只，糖尿病組死亡2只。經(jīng)超聲檢測在糖尿病組中選出符合糖尿病心肌病的模型，共18只。將18只符合糖尿病心肌病的大鼠隨機分成DCM組和DIZE組， 各9只， DIZE組通過滲透性微泵皮下輸注DIZE (15 mg·kg-1·d-1)，DCM組予以皮下輸注等量生理鹽水，共4周。干預(yù)過程中因并發(fā)癥或其它原因DCM組與DIZE組各死亡1只大鼠。

3.2動物一般情況的觀察 16周末稱量各組大鼠體重(body weight，BW)并采用尾尖采血法檢測血糖，應(yīng)用10% 水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后稱量體重。心臟采血處死后使用0.9%生理鹽水心臟灌注，取心臟并稱心重(heart weight, HW)，計算心重與體重比(HW/BW， %)。

3.3心功能的測定和心臟形態(tài)學(xué)觀察 16周末檢測各組大鼠心臟功能。通過多普勒超聲檢測左室舒張早期最大血流/二尖瓣心房收縮期最大血流(E/A)、 左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、 左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、心臟射血分數(shù)(ejection fraction,EF)和左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)。將取材完畢后的心肌組織置入4% 多聚甲醛溶液中固定， 48 h 后進行脫水浸蠟、石蠟包埋并制作厚4.5 μm切片，做常規(guī)HE 染色和Masson 染色。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析。

3.4免疫組化觀察心臟白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表達 心臟組織切片經(jīng)脫蠟至水后經(jīng)10% EDTA 液微波加熱至96 ℃，維持溫度20 min進行抗原修復(fù)，自然復(fù)溫后使用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，并用山羊血清37 ℃封閉0.5 h。封閉后分別加入抗IL-1、IL-6和CTGF抗體(1∶200) 4 ℃ 孵育過夜，滴加Ⅱ抗，37 ℃ 孵育20 min，DAB 顯色。顯色后呈棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。蘇木素染核，脫水封片。圖像采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析。

3.5Western blot測定大鼠心肌組織中ACE2蛋白的表達 取大鼠新鮮心肌組織30 mg左右，稱重、加入液氮研碎后，每100 mg 加入預(yù)冷的裂解緩沖液(RIPA∶PMSF=100∶1)1.0 mL置于冰上放置30 min，使其裂解充分；4 ℃、14 000 r/min 離心15 min, 吸取上清。并用BCA 法測定蛋白濃度。上清充分混合5× 蛋白上樣緩沖液后，于100 ℃煮沸變性10 min，用8% SDS-PAGE、80～120 V電壓分離蛋白質(zhì)，電泳后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到經(jīng)甲醇處理過的PVDF上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后加 I 抗(ACE2 及GAPDH 抗體分別用Ⅰ抗稀釋液1∶1 000 稀釋)及 II抗孵育，最后經(jīng)化學(xué)發(fā)光儀發(fā)光，采用ImageJ 軟件處理圖像。

3.6大鼠血漿AngⅡ和Ang-(1-7) 含量的測定 心臟取血約7～10 mL，存放于EDTA 抗凝管中，3 000 r/min，離心15 min 后取上清。采用ELISA 測定血漿中AngⅡ和Ang-(1-7)的水平，具體步驟按試劑盒說明書操作，包括加樣、孵育、洗滌、顯色并終止反應(yīng)。終止后使用酶標儀在450 nm 波長上讀出各孔吸光度(A)值，并根據(jù)試劑盒提供的標準品制作標準曲線，計算各組大鼠血漿AngⅡ和Ang-(1-7)的含量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Satterthwaite矯正后t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DIZE對動物一般情況的影響

正常對照組大鼠體重和飲食、飲水狀況正常，精神狀態(tài)好，毛皮有光澤，反應(yīng)靈敏；DCM組和DIZE組大鼠較正常對照組體重明顯下降(P<0.05)，血糖明顯升高(P<0.05)，HW/BW也明顯升高。與DCM 組相比，DIZE 組大鼠精神狀態(tài)較好，體重及HW/BW明顯降低(P<0.05)，但血糖的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表1。

表1各組大鼠一般情況變化

Table 1. The changes of general situation of the rats in each group (Mean±SD.n=8)

GroupBW(g)HW/BW(%)Glu(mmol/L)N452.5±8.60.03±0.025.14±0.10DIZE335.7±8.7*#0.04±0.01*#25.76±0.51*DCM290.1±5.9*0.04±0.01*24.21±0.50*

BW: body weight； HW: heart weight; Glu: blood glucose.*P<0. 05vsN group;#P<0. 05vsDCM group．

2 DIZE對心功能的影響

與正常組比較，DCM組LVEDD和LVESD明顯升高，E/A、EF和FS 明顯下降(P<0.05)；DIZE治療組較DCM組LVEDD、LVESD、E/A、EF和FS均明顯改善(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Comparison of echocardiographic findings at 16 weeks in each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsDCM group.

圖1各組大鼠16周末超聲心動圖檢測結(jié)果

3 DIZE對心肌纖維化的影響

3.1HE染色的結(jié)果 HE染色觀測各組大鼠心肌大體形態(tài)，正常組大鼠心肌細胞排列整齊、致密，染色均勻，未見肌纖維溶解；糖尿病心肌病組大鼠心肌細胞肥大，有較明顯心肌纖維損傷和斷裂；DIZE治療組與糖尿病心肌病組相比，心肌細胞肥大和壞死程度減輕，細胞形態(tài)大體完整，見圖2A。

3.2Masson染色的結(jié)果 正常組大鼠膠原纖維呈藍色，少量均勻分布，胞漿呈紅色；糖尿病心肌病組心肌間質(zhì)及血管周圍膠原纖維表達明顯增加；與DCM組相比，DIZE治療組膠原明顯減少，見圖2B。

4 各組大鼠心肌組織中CTGF、IL-1和IL-6免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果

與對照組比較，DCM組大鼠心肌組織中CTGF陽性表達強度顯著增加，圖像分析CTGF 蛋白表達水平顯著升高；與DCM組比較，DIZE組大鼠心肌組織中CTGF蛋白表達水平明顯降低。與對照組比較，糖尿病組大鼠心肌組織中IL-1和IL-6陽性表達強度顯著增加，圖像分析IL-1和IL-6蛋白表達水平顯著升高；與DCM組比較，DIZE組大鼠心肌組織中IL-1和IL-6蛋白表達水平明顯降低，見圖3。

Figure 2. The representative images of HE staining (A) and Masson staining (B) in each group under light microscope (×400)．

圖2各組大鼠心肌組織HE染色和Masson染色結(jié)果

Figure 3. The representative images of immunohistochemical staining for CTGF, IL-6 and IL-1 in each group under light microscope (×400)．

圖3各組大鼠心肌組織CTGF、IL-1和IL-6的免疫組化觀察結(jié)果

5 Western blot測定DIZE 對DCM大鼠心肌中ACE2蛋白表達量的影響

與對照組比較，DCM組大鼠心肌組織中ACE2蛋白表達量明顯降低；DIZE組大鼠心肌中ACE2蛋白的表達量明顯高于DCM組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The protein expression of ACE2 in each group detected by Western blot． Mean±SD.n=4.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsDCM group．

圖4各組大鼠心肌中ACE2蛋白表達

6 大鼠血漿AngⅡ和Ang-(1-7)含量的變化

與正常組大鼠相比，DCM 組大鼠血漿AngⅡ水平明顯上升，Ang-(1-7) 水平明顯下降(P<0.05); 而經(jīng)DIZE 干預(yù)治療后，DIZE組大鼠血漿AngⅡ水平下降，Ang-(1-7)水平上升(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The plasma concentrations of AngⅡ and Ang-(1-7) in different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsDCM group．

圖5各組大鼠血清中AngⅡ和Ang-(1-7)含量的比較

討 論

糖尿病心肌病的發(fā)病機理復(fù)雜，主要涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活。RAS系統(tǒng)是生物體內(nèi)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，還存在于腎臟、腎上腺、血管壁及心臟等組織中，從而參與對靶器官的調(diào)節(jié)。在糖尿病心肌病的發(fā)展過程中，心肌局部的RAS系統(tǒng)被激活，心肌中AngⅡ水平升高直接作用于心肌，促進心肌纖維化及心肌炎癥反應(yīng)，從而影響心功能[9]。Ang-(1-7)是RAS中的另一成員，具有拮抗Ang II的作用[10-11]。Hao等[12]研究表明，Ang-(1-7)有效減輕了糖尿病發(fā)生時左右心室的纖維化及氧化應(yīng)激。Ebermann等[13]發(fā)現(xiàn)，Ang-(1-7)可以降低與肥胖相關(guān)的2型糖尿病小鼠的身體脂肪量和炎癥，并增強了全身胰島素敏感性從而改善心臟能量代謝及心臟脂毒性，證明了Ang-(1-7)在糖尿病性心肌病中的保護作用。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2作為新近發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的同源物，可直接水解AngⅡ。相比其它底物，ACE2和Ang Ⅱ的親和力最高，所以催化AngⅡ 轉(zhuǎn)化為Ang-(1-7)又被認為是ACE2最重要的功能。ACE2通過ACE2—Ang-(1-7)—Mas軸調(diào)節(jié)RAS。本課題組已有動物實驗顯示ACE2過表達可抑制DCM心肌中膠原蛋白的積累和改善左室重建，改善心功能。Lai等[14]發(fā)現(xiàn)ACE2可以減少阿霉素誘導(dǎo)的心臟功能障礙。Basu等[15]的臨床實驗證明重組人ACE2分別有效地將Ang-(1-10)和Ang II代謝成Ang-(1-9)和Ang-(1-7)。治療組中擴張型心肌病心肌AngⅡ通過ACE2有效轉(zhuǎn)化為Ang(1-7)，從而改善心臟衰竭[15]。大量實驗均證明ACE2對心肌具有保護作用。DIZE作為最近發(fā)現(xiàn)的ACE2內(nèi)源性激動劑，可以增強ACE2活性。本課題組已有研究發(fā)現(xiàn)DIZE可以減少纖維化和炎癥改善糖尿病導(dǎo)致的腎臟纖維化，提示DIZE可能通過負向調(diào)節(jié)RAS在糖尿病心肌病中也存在保護作用。

在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著炎癥細胞因子，巨噬細胞以及膠原含量的顯著增加[1]。因此改善心肌炎癥及纖維化是改善糖尿病心肌病的重要指標。本實驗結(jié)果顯示，DIZE治療后較DCM組心肌中Ang-(1-7)水平升高，Ang II水平降低；DIZE治療組大鼠心肌中Ang-(1-7)下游的炎癥因子及膠原的含量較DCM明顯下降；并通過超聲檢測發(fā)現(xiàn)DIZE在一定程度上改善了糖尿病心肌病大鼠的心功能。說明DIZE內(nèi)源性地激活了ACE2，明顯提高了心肌中ACE2的活性，從而抑制了心肌纖維化，減輕了炎癥并在一定程度上改善了心功能。

綜上所述，DIZE作為ACE2激動劑，對糖尿病心肌病大鼠起到了保護作用，為臨床中糖尿病心肌病的治療提供了新的思路。但DIZE作為一種新的治療糖尿病心肌病的藥物，其具體機制值得我們進一步研究。

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