張春晶, 李淑艷, 趙容杰， 趙正林△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)教研室， 2精神衛(wèi)生學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘)，是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)過(guò)敏性疾病，以氣道高反應(yīng)性和慢性炎癥為特點(diǎn)，目前嚴(yán)重危害人體健康，發(fā)病率逐年增高。其主要生化和病理變化為整體和局部(呼吸系統(tǒng))免疫炎癥反應(yīng)的紊亂，尤其是以嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,EOS)、肥大細(xì)胞(mast cell)及其所分泌的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子反應(yīng)為主的氣道非特異性炎癥[1]。關(guān)于哮喘的發(fā)病機(jī)制不是很明確，但通過(guò)一系列研究發(fā)現(xiàn)，與輔助性T細(xì)胞(helper T-cell， Th)1與Th2細(xì)胞的異常分化與功能異常引起的繼發(fā)性的炎癥因子表達(dá)增多和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào)密切相關(guān)。人參是廣泛利用的傳統(tǒng)名藥，已經(jīng)分離出數(shù)十種有效單體成分，其中人參皂苷Rh1(ginsenoside Rh1)具有明顯的抗腫瘤、抗炎癥以及免疫調(diào)節(jié)作用，具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能的作用，而且沒(méi)有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此成為臨床上常用的名貴藥材之一[2-3]。人參皂苷Rh1具有抗哮喘作用，但其對(duì)哮喘的免疫學(xué)機(jī)制尚未有深入的研究。為了進(jìn)一步考察人參皂苷Rh1對(duì)支氣管哮喘是否具有緩解作用,本實(shí)驗(yàn)利用小鼠制作哮喘模型，觀察了人參皂苷Rh1對(duì)血清和支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中各種炎癥因子的變化，肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)-β1的表達(dá)和對(duì)肺組織病理學(xué)變化的影響。

材 料 和 方 法

1 主要藥品與試劑

人參皂苷Rh1購(gòu)于韓國(guó)嶺南藥業(yè)公司，純度>98%； 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和氫氧化鋁(分析純) 購(gòu)自Sigma；白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-4、IL-5和干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)的ELISA試劑盒購(gòu)自上海晶美生物制藥有限公司；小鼠IgE和IgG試劑盒購(gòu)自上海億欣生物科技有限公司；抗小鼠TGF-β1抗體購(gòu)自R&D；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司。

2 方法

2.1動(dòng)物及分組 取雌性BALB/c小鼠40 只， 6～8周齡, 體重(20.0±2.0)g，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)，隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control)組、哮喘模型(asthma model)組、人參皂苷Rh1小劑量治療(low-dose treatment)組和人參皂苷Rh1大劑量治療(hing-dose treatment)組，每組10只。在溫度20 ℃～25 ℃, 濕度30%～35%, 自動(dòng)空氣清潔設(shè)備的條件下飼養(yǎng)，自由攝食。

2.2哮喘模型的制備以及給藥方法 小鼠于實(shí)驗(yàn)第1天和第7天分別腹腔注射OVA抗原液0.2 mL，全身致敏2 次。第15天起將小鼠置于自制的封閉玻璃密閉容器內(nèi), 將卵清蛋白溶解于 PBS制作1%的溶液，用噴霧器霧化攻擊，每天30 min，誘導(dǎo)小鼠氣道過(guò)敏，連續(xù)激發(fā)刺激2周。人參皂苷Rh1治療組于實(shí)驗(yàn)第15天起在激發(fā)刺激前30 min，分別灌胃人參皂苷Rh1 40 mg/kg和80 mg/kg，每天一次。正常對(duì)照組按照上述方法利用相同劑量生理鹽水代替進(jìn)行腹腔注射、激發(fā)刺激和灌胃。

2.3標(biāo)本的處理和EOS的計(jì)數(shù) 在末次激發(fā)攻擊24 h后，用3%戊巴比妥鈉(1 mL)腹腔注射處死動(dòng)物, 經(jīng)心臟穿刺取血液，分離血清后，儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。小鼠處死后，打開(kāi)胸腔，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，經(jīng)氣管插管，用Hanks液灌洗左肺, 每次5 mL, 共6次, 計(jì)30 mL，收集灌洗液，離心制成細(xì)胞懸液，獲得BALF?；靹蚴占腂ALF，離心后取上清液，分裝于試管封閉后在-20 ℃保存；另外，在沉淀里加入紅細(xì)胞溶解緩沖液200 μL，充分混合在冰塊里放置2 min，然后加入800 μL 的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，4 000 r/min離心3 min，除去上清液，取沉淀再加1 mL RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，搖勻后取20 μL做細(xì)胞記數(shù)，最終取4×104個(gè)細(xì)胞用Diff-Quik染色，觀察EOS的數(shù)量。解剖小鼠迅速取右肺下小葉，放入液氮速凍，用于Western blot測(cè)定；取出左肺下葉用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后，經(jīng)顯微鏡觀察肺組織的病理學(xué)變化。

2.4免疫球蛋白的測(cè)定 于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入卵清蛋白(5 mL/L，PBS緩沖液配制) 4 ℃ 過(guò)夜，用PBS緩沖液沖洗，然后加入1% BSA(PBS緩沖液配制)，每孔150 μL，在37 ℃ 培養(yǎng)1 h，用PBS緩沖液沖洗。把已經(jīng)取好的血清用緩沖液稀釋后，每孔加入200 μL在 37 ℃ 培養(yǎng)3 h，用PBS緩沖液沖洗。將IgE和IgG抗體用緩沖液稀釋后，每孔加入100 μL 37 ℃ 培養(yǎng)2 h，再用PBS緩沖液沖洗，最后取底物用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)配成1 g/L，每孔加入100 μL，分別培養(yǎng)15 min(IgG)和12 h(IgE)，于波長(zhǎng)405 nm和492 nm下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(A)。

2.5細(xì)胞炎癥因子的測(cè)定 采用ELISA法，參照試劑盒說(shuō)明書，分別檢測(cè)BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ 表達(dá)水平的變化。

2.6Western blot檢測(cè) 取液氮保存的肺組織解凍，制備勻漿離心，取上清按照蛋白濃度檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明操作。將已獲得的各組蛋白質(zhì)按照常規(guī)操作方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，并加入抗TGF-β1抗體反應(yīng)24 h，用ECL顯色。利用圖像分析系統(tǒng)掃描，用β-actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人參皂苷Rh1對(duì)BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的影響

BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與哮喘模型組比較，人參皂苷Rh1大劑量組和小劑量組嗜酸性粒細(xì)胞均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rh1小劑量組比較，人參皂苷Rh1大劑量組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2 人參皂苷Rh1對(duì)血清中免疫球蛋白IgE和IgG變化的影響

與正常組比較，哮喘模型組血清中的IgE和IgG明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與哮喘模型組比較，人參皂苷Rh1治療組血清中的IgE 明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但是血清IgG的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；與人參皂苷Rh1小劑量組比較，大劑量組中IgG水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3 人參皂苷Rh1對(duì)BALF中 IL-4、IL-5和IFN-γ水平的影響

BALF中的 IL-4、IL-5和IFN-γ有特征性變化。與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； 與哮喘模型組比較，人參皂苷Rh1大劑量組、小劑量組IL-4、IL-5和IFN-γ 減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與人參皂苷Rh1小劑量組比較，大劑量組中僅IFN-γ水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1人參皂苷Rh1對(duì)BALF中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血清中IgE和IgG水平的影響

Table 1. The effects of ginsenoside Rh1 on the number of eosinophils in BALF and the serum concentrations of IgE and IgG (Mean±SD.n=10)

GroupEosinophils(×109/L)IgE(μg/L)IgG(μg/L)Normalcontrol13.16±2.141.000±0.0231.000±0.207Asthmamodel166.33±29.16##1.365±0.031##7.114±0.888##Low-dosetreatment82.43±12.04##$1.203±0.024$6.042±1.012High-dosetreatment26.26±4.29##$$&&1.144±0.023$$5.894±0.912&

##P<0.01vsnormal control group;$P<0.05,$$P<0.01vsasthma model group;&P<0.05，&&P<0.01vslow-dose treatment group.

表2 人參皂苷Rh1對(duì)BALF中IL-4、 IL-5和IFN-γ水平的變化

##P<0.01vsnormal control group;$P<0.05,$$P<0.01vsasthma model group;&P<0.05vslow-dose treatment group.

4 各組小鼠肺組織病理學(xué)的變化

各組小鼠肺組織經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果如下：正常對(duì)照組小鼠肺組織細(xì)支氣管和肺泡壁結(jié)構(gòu)完整、界限清楚，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；哮喘模型組小鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管上皮損傷缺失，上皮細(xì)胞增厚，在支氣管及其周圍充血，有大量的嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致支氣管管腔狹窄；人參皂苷Rh1大、小劑量組肺組織支氣管及其周圍組織炎癥細(xì)胞明顯減少，肺組織紋理清晰，顯著改善肺組織病理變化，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Pathological changes of mouse lung tissues (HE staining, × 200). A: normal control group; B: asthma model group; C: low-dose treatment group; D: high-dose treatment group.

圖1各組小鼠肺組織病理學(xué)變化

5 肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；人參皂苷Rh1小劑量組和大劑量組的TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與小劑量組比較，人參皂苷Rh1大劑量組的TGF-β1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The protein expression of TGF-β1 in mouse lung tissures. Mean±SD.n=10.#P<0.05,##P<0.01vsnormal control group;$$P<0.01vsasthma model group;&P<0.05vslow-dose treatment group.

圖2各組肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)

討 論

支氣管哮喘是以氣道內(nèi)各種炎癥細(xì)胞的彌漫性浸潤(rùn)為主要病變的氣道炎癥性疾病，其發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，與不同類型的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)以及它們之間相互作用密切相關(guān)。近年來(lái)，隨著對(duì)支氣管哮喘研究的深入，從不同角度的研究結(jié)果表明，免疫學(xué)功能變化為其主要機(jī)制。多年的研究結(jié)果認(rèn)為，哮喘的發(fā)病機(jī)制與Th1/Th2細(xì)胞的異常分化以及調(diào)控比例失衡有關(guān)。Th1/Th2功能失衡是哮喘發(fā)病的主要原因[4-5]。各類T細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，對(duì)體內(nèi)的免疫功能起協(xié)調(diào)作用。Th1細(xì)胞分泌 IFN-γ、IL-2和 TNF-β1等，主要參與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)、過(guò)敏和細(xì)胞免疫過(guò)程。尤其IFN-γ 是Thl 細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，可控制Th2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，保持Thl /Th2的相對(duì)平衡。Th2細(xì)胞主要刺激B細(xì)胞增殖活化產(chǎn)生抗體，主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[6-7]，并分泌IL-4和IL-5等細(xì)胞因子，誘發(fā)哮喘的氣道炎癥反應(yīng)，其中起關(guān)鍵作用的IL-4能促進(jìn) B細(xì)胞分化、增殖和活化，誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性 IgE，參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展。此外，IL-4和IL-5促進(jìn)EOS在哮喘氣道中的聚集和彌漫性浸入，同時(shí)抑制EOS的凋亡，加重氣道內(nèi)的炎癥過(guò)程。因此，利用中醫(yī)藥治療支氣管哮喘在不同的角度深入，對(duì)支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的各個(gè)方面進(jìn)行了氣道慢性炎癥的發(fā)病原因、體內(nèi)免疫調(diào)控機(jī)制等環(huán)節(jié)的分析[8]。人參具有滋補(bǔ)元?dú)?，?qiáng)壯機(jī)體，安神益智，調(diào)節(jié)代謝，提高免疫等多種藥效。因此，對(duì)穩(wěn)定全身各系統(tǒng)的相互作用有重要的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用卵蛋白誘導(dǎo)小鼠哮喘模型，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中免疫球蛋白IgE和IgG的變化，以及BALF中的IL-4、IL-5和IFN-γ的變化，證實(shí)了人參皂苷Rh1對(duì)哮喘的治療作用，并解釋了哮喘的發(fā)病機(jī)制。從表2中可知，IL-4和IL-5為主的Th2細(xì)胞因子的增多是Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)反應(yīng)，這是哮喘的主要發(fā)病機(jī)制之一。但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠的BALF中Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ水平明顯增多。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為提高Th1細(xì)胞因子會(huì)緩解哮喘作用，但也有完全相反的報(bào)道。在哮喘發(fā)病過(guò)程中Th2細(xì)胞因子的機(jī)制相對(duì)較明確，而Th1相關(guān)的細(xì)胞因子的作用需要進(jìn)一步探討。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，Th1相關(guān)的細(xì)胞因子為靶點(diǎn)是哮喘治療的有效方法之一。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明人參皂苷Rh1能明顯抑制IL-4和IL-5等Th2 細(xì)胞因子，同時(shí)抑制IFN-γ為主的Thl 細(xì)胞因子，改變Th1/Th2細(xì)胞的平衡，抑制Th2細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)反應(yīng)一定程度上逆轉(zhuǎn)Th1/Th2功能失衡，達(dá)到緩解哮喘的作用。本研究結(jié)果可知，哮喘模型組IL-4、IL-5和IgE的表達(dá)顯著高于正常組，說(shuō)明哮喘小鼠Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)亢進(jìn)。人參皂苷Rh1治療組的 IL-4、IL-5和IgE 顯著低于哮喘模型組，證明通過(guò)降低IL-4和IL-5的合成，抑制IgE 的表達(dá)，能減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。

支氣管哮喘的氣道病理變化與多種炎癥細(xì)胞有關(guān)。如EOS、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。EOS在哮喘的發(fā)病中起很重要的作用,已知BALF和血中EOS數(shù)量增加。EOS參與支氣管哮喘的氣道的損傷過(guò)程，還能合成和釋放白三烯、血小板活化因子等多種炎癥介質(zhì), 誘發(fā)免疫系統(tǒng)加重哮喘的癥狀[10]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠誘發(fā)模型后氣道灌洗液中EOS明顯增多，是引起哮喘的主要原因，經(jīng)人參皂苷Rh1治療后，氣道灌洗液中的EOS隨之減低[8-9]。 研究表明,哮喘患者BALF中存在大量活化的Th2 細(xì)胞, 并且其IL-4和IL-5的mRNA 表達(dá)水平升高, 程度與肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)呈顯著正比, 因此從哮喘發(fā)病機(jī)制的角度來(lái)看，調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞的分化以及細(xì)胞因子的相對(duì)平衡是治療哮喘最有效的途徑[11-13]。本研究中，哮喘小鼠BALF 中IL-4、IL-5和IFN-γ明顯增高，與正常對(duì)照組相比炎癥細(xì)胞總數(shù)和EOS 均增高。目前應(yīng)用于哮喘治療的藥物很多，其中比較常見(jiàn)的糖皮質(zhì)激素以抑制炎癥為主, 能抑制哮喘氣道各種細(xì)胞因子的表達(dá)。雖然有較好的療效, 但并不能從根本上解決疾病的發(fā)病和進(jìn)展, 副作用明顯，也不能完全調(diào)控Th1/Th2 功能失衡[14]。本研究認(rèn)為，人參皂苷Rh1能有效控制哮喘發(fā)病過(guò)程中的炎性因子的表達(dá)，是一個(gè)良好的抗過(guò)敏的中藥，應(yīng)用于過(guò)敏性疾病的治療。

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