劉江濤 李亭亭 王振波

【摘 要】 目的 檢測I-TAC及其受體CXCR3在乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)差異，探討I-TAC/CXCR3生物軸在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法 收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬濱州市中心醫(yī)院普外科經(jīng)手術(shù)切除的40例乳腺癌組織作為實(shí)驗(yàn)組，同時收集相應(yīng)的40例癌旁正常乳腺組織作為對照組。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測各組織I-TAC及CXCR3 在mRNA及蛋白水平的表達(dá)差異，并分析CXCR3的表達(dá)與乳腺癌常見臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 I-TAC及CXCR3在乳腺癌組織中mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均顯著高于癌旁乳腺組織，差異分別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。臨床病理參數(shù)分析提示，CXCR3的表達(dá)與乳腺癌組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與乳腺癌患者的年齡、腫瘤分期及大小等無關(guān)。結(jié)論 乳腺癌組織中存在I-TAC及其受體CXCR3的過度表達(dá)，I-TAC/CXCR3信號傳導(dǎo)通路可能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程可能扮演重要角色。

【關(guān)鍵詞】趨化因子；I-TAC；CXCR3；乳腺癌。

Abstract Objective： To detect the expression of I-TAC and its receptor CXCR3 in brest carcinoma， and to explore the role of I-TAC/CXCR3 biological axis in the occurrence and development of breast cancer. Methods： 40 cases of breast cancer tissues from general surgery of Binzhou Central Hospital affiliated to Binzhou Medical College were collected as experimental group， and 40 cases of normal breast tissues adjacent to cancer were collected as control group. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemistry were used to detect the expression of I-TAC and CXCR3 at mRNA and protein levels， respectively. Finally， the relationship between the expression of CXCR3 and common clinicopathological parameters of breast cancer was analyzed. Results： The expression of I-TAC and CXCR3 in breast cancer tissues was significantly higher than that in adjacent breast tissues （P < 0.05）. The expression of CXCR3 was positively correlated with histological differentiation and lymph node metastasis of breast cancer， but not with age， tumor stage and size of breast cancer patients. Conclusion： I-TAC and its receptor CXCR3 are overexpressed in breast cancer tissues， and I-TAC/CXCR3 signaling pathway may play an important role in the occurrence and development of breast cancer.

Key words Chemokines；I-TAC；CXCR3；Breast carcinoma.

【中圖分類號】R446.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）19-0-01

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，據(jù)2016年世界癌癥組織發(fā)布的臨床腫瘤資料顯示全球范圍內(nèi)每年新發(fā)乳腺癌患者近200萬，約占女性所有惡性腫瘤的四分之一，而每年因乳腺癌而死亡的患者超過60萬人，約占女性惡性腫瘤死亡人數(shù)的20%[1]。在國內(nèi)，乳腺癌自上世紀(jì)70年代末以來發(fā)病率一直呈逐年上升趨勢，已發(fā)展為女性發(fā)病率第一的惡性腫瘤。2016年中國新發(fā)乳腺癌患者約20萬人，高居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位，嚴(yán)重威脅女性健康。乳腺癌的預(yù)防和診治已成為全世界面臨的重大公共衛(wèi)生問題[2]。盡管目前乳腺癌的基礎(chǔ)研究與臨床治療均取得較大的進(jìn)步，但仍有接近35%的早期乳腺癌患者發(fā)生腫瘤的遠(yuǎn)處浸潤或切除術(shù)后復(fù)發(fā)[3]，導(dǎo)致乳腺癌患者的死亡率居高不下。趨化因子的主要作用是趨化細(xì)胞的遷移， 趨化因子通過與受體結(jié)合激活后，可引起腫瘤增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移等信號通路的活化。目前證實(shí)趨化因子受體及其配體在多種惡性腫瘤如甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌及結(jié)直腸腫瘤等組織中均高表達(dá)。本文通過RT-PCR技術(shù)以及免疫組化技術(shù)分別檢測趨化因子I-TAC及其受體CXCR3在乳腺癌組織中的表達(dá)水平，并初步揭示I-TAC/CXCR3信號通路在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

病歷資料及試劑： 所有乳腺癌患者臨床及病理資料齊全，且術(shù)前均未進(jìn)行過任何形式的抗腫瘤治療。癌旁正常乳腺組織為距離腫瘤5 cm以外的正常乳腺組織，且病理切片未見腫瘤細(xì)胞?；颊吣挲g33-72歲，平均年齡45歲。乳腺癌患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例、無轉(zhuǎn)移11例。TNM 分期： I 期 11 例，Ⅱ期 20 例，Ⅲ期 9 例。組織學(xué)分級： I 級 5 例，Ⅱ級 17 例，Ⅲ級 18 例。鼠抗人CXCR3抗體（ab64714）購于abcam公司，兔抗人I-TAC單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， CXCR3及I-TAC 抗體均采用1：200稀釋，DAB顯色、蘇木素復(fù)染透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。PBS代替一抗做陰性對照。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測 I-TAC 及 CXCR3 mRNA的表達(dá)：分別收集乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織，并用 Trizol 法提取總RNA。根據(jù)TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書，進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)Medline基因文庫用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，目的基因I-TAC引物：上游：5-CAAGGCTTCCCCATGTTCA-3；下游：5-CCCAGGGCGTATGCAAAGA-3；產(chǎn)物長度為105 bp，退火溫度為60℃。CXCR3引物：上游：5-GCCCAAGAATAGATGCTGACTG-3下游：5-TGAAAGGAGAAGAGCCTGAAGTG-3；產(chǎn)物長度為165 bp，退火溫度為56℃。內(nèi)參β-actin的上游引物為：5-CAACGGCTCCGGCATGT-3，下游引物為：5-CCACACGCAGCTCATTGTAGAA-3，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為257 bp，退火溫度55℃。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、Bio-PAD凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶灰度值。目的條帶mRNA表達(dá)相對強(qiáng)度=目的條帶mRNA灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定：采用SP法，組織切片常規(guī)脫蠟至水洗；3%的過氧化氫處理10 min后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min；滴加封閉液（10%山羊血清）15 min；加一抗37℃2 h（陰性對照用PBs代替一抗）；PBS洗3次，每次5 min；生物素標(biāo)記二抗37℃15 min；PBS洗3次，每次5 min；過氧化物酶（HRP）標(biāo)記鏈霉卵白素15 min；PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色3 min；水洗，蘇木精復(fù)染、封固。隨機(jī)選取10個視野，計(jì)算每個高倍視野（×400）下分別計(jì)數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，取均值，并由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師分別雙盲閱片，按腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞率和著色強(qiáng)度分別進(jìn)行記分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 I-TAC、CXCR3 mRNA水平的表達(dá)：I-TAC mRNA在乳腺癌組中相對表達(dá)量為0.76 ± 0.11，在癌旁正常乳腺組織中表達(dá)為0.39 ± 0.07，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。CXCR3在乳腺癌組織中mRNA水平的相對表達(dá)量為0.85±0.10，而在癌旁正常乳腺組織中表達(dá)為0.44±0.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

2.2 I-TAC、CXCR3 蛋白水平的表達(dá)：I-TAC在乳腺癌組有32例陽性表達(dá)，陽性率80.0%，而其在癌旁正常乳腺組有22例陽性表達(dá)，陽性率55.0%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；乳腺癌組CXCR3表達(dá)陽性的27例，陽性率67.5%，而癌旁相應(yīng)正常乳腺組織中CXCR3表達(dá)陽性有16例，陽性率40.0%。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，見表2）。

2.3 CXCR3表達(dá)與乳腺癌常見臨床病理參數(shù)的關(guān)系：CXCR3表達(dá)與乳腺癌患者組織分化程度及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（X2 = 8.391、5.277，P<0.05）。結(jié)果提示，腫瘤低分化組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組乳腺癌患者CXCR3陽性表達(dá)率均分別高于腫瘤高分化組及淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組。CXCR3表達(dá)高低與乳腺癌患者年齡，病理分期以及腫瘤大小等無顯著關(guān)系。

3 討論

趨化因子受體CXCR3是一種G蛋白偶聯(lián)受體，包括三種結(jié)構(gòu)類似的特異性配體如干擾素γ誘生單核因子（MIG，又名CXCL9），干擾素γ誘導(dǎo)性肽10（又名CXCL10）以及干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞α趨化因子（I-TAC，又名CXCL11）等，CXCR3與其配體結(jié)合后能誘導(dǎo)活化的效應(yīng)細(xì)胞向特定組織遷移，參與機(jī)體免疫和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[4]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道CXCR3在消化道系統(tǒng)腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤以及婦科腫瘤等多種不同腫瘤組織中表達(dá)活躍，基礎(chǔ)研究也證實(shí)，趨化因子可能在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色，包括穿入血管、錨定、穿出血管、免疫逃逸以及血管生成等，CXCR3與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的可能機(jī)制是CXCR3高表達(dá)的惡性腫瘤細(xì)胞容易遷徙至表達(dá)其配體的特異性靶器官[5]。CXCR3在在結(jié)腸癌、胃癌和肝癌等腫瘤組織中陽性表達(dá)率較高，而在其相應(yīng)癌旁組織或正常上皮組織中表達(dá)較弱或者不表達(dá)，且CXCR3的表達(dá)與病理分期、腫瘤組織分化或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，此外，CXCR3強(qiáng)陽性的腫瘤患者預(yù)后一般較差[6]。文獻(xiàn)亦有報(bào)道趨化因子受體CXCR3與其配體在腫瘤中的作用，如BAI[7]等報(bào)道結(jié)腸癌組織中CXCR3及CXCL10是表達(dá)顯著上調(diào)的，且CXCR3的表達(dá)水平高低可以作為評估進(jìn)展期結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。腎癌細(xì)胞可高表達(dá)趨化因子受體CXCR3，并通過與配體CXCLl0相互作用，介導(dǎo)腎癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。許超等[9]報(bào)道了CXCR3-CXCLl0生物軸在結(jié)直腸腫瘤中的作用，通過體外遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CXCLl0對高表達(dá)CXCR3的結(jié)腸癌細(xì)胞SW620和HT29的趨化作用非常顯著，而低表達(dá)CXCR3的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480趨化作用不明顯，這些結(jié)果初步提示體內(nèi)CXCLl0對高表達(dá)CXCR3的腫瘤細(xì)胞具有一定趨化作用。目前I-TAC/ CXCR3在乳腺癌組織中的作用尚未見報(bào)道。我們通過運(yùn)用RT-PCR法和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中I-TAC及CXCR3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中I-TAC及CXCR3無論mRNA水平還是蛋白水平的表達(dá)均顯著高于癌旁正常乳腺組織。如CXCR3在乳腺癌組27例陽性表達(dá)，陽性率為67.5%；CXCR3在癌旁正常乳腺組織中16例陽性表達(dá)，陽性率為40.0%；I-TAC在乳腺癌組有32例陽性表達(dá)，陽性率80.0%，I-TAC在癌旁正常乳腺組織中有22例陽性表達(dá)，陽性率為55.0%。此外，臨床病理參數(shù)分析提示CXCR3的表達(dá)與腫瘤組織分化及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，證實(shí)I-TAC/ CXCR3生物軸在乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定的作用。

趨化因子受體及配體系統(tǒng)與腫瘤的關(guān)系具有雙向性[10-11]。趨化因子受體及其配體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控受諸多因素的影響，故其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系還有待深入研究。但可以預(yù)見， 合理的應(yīng)用趨化因子或其受體可有效地誘導(dǎo)、活化、趨化免疫效應(yīng)細(xì)胞， 引導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，趨化因子相關(guān)的基因靶向治療有望成為新的腫瘤治療策略和手段。

參考文獻(xiàn)

Jemal A， Bray F， Center M M， et al. Global cancer statistics[J]. Ca A Cancer Journal for Clinicians， 2015， 61（2）：69-90.

韓小偉， 柳偉偉， 陽澤龍，等. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺癌臨床流行病學(xué)16年演變趨勢[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2016， 23（24）：1597-1600.

駱成玉. 乳腺癌治療從標(biāo)準(zhǔn)到精準(zhǔn)微創(chuàng)[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 37（3）：331-335.

Zhou H， Wu J， Wang T， et al. CXCL10/CXCR3 axis promotes the invasion of gastric cancer via PI3K/AKT pathway-dependent MMPs production[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2016， 82：479-488.

Xia J B， Mao C Z， Chen Z Y， et al. The CXCL10/CXCR3 axis promotes cardiac microvascular endothelial cell migration via the p38/FAK pathway in a proliferation-independent manner.[J]. Experimental & Molecular Pathology， 2016， 100（2）：257-265.

Xia J B， Liu G H， Chen Z Y， et al. Hypoxia/ischemia promotes CXCL10 expression in cardiac microvascular endothelial cells by NFkB activation.[J]. Cytokine， 2016， 81：63-70.

Ming B， Xia C， Ba Y I. CXCL10/CXCR3 overexpression as a biomarker of poor prognosis in patients with stage II colorectal cancer[J]. Mol Clin Oncol， 2016， 4（1）：23-30.

徐遵禮， 王林輝， 陳偉，等. CXCR3在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 33（6）：690-691.

許超，王強(qiáng)，蔡清萍，等。CXCR3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志.2005，25（5）：609-611.

陳瑜，張德新，郭長存，等.趨化因子受體CXCR3在胃癌中的表達(dá)[J] 胃腸病學(xué)，2004，9（5）：266-269。

丁小霞，王健. 趨化因子受體CXCR3在HCC中的作用[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志（Chin J Cell Mol Immuno1）2009，25（4）：374-376.