基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的單堿基基因編輯技術(shù)及其在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

張愛霞，趙 宇，安 靜，羅 影，陳志國

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心，北京 100053；2.北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷和修復(fù)所，北京 100053；3.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015）

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)基因（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated genes，CRISPR/Cas）系統(tǒng)是細(xì)菌或古細(xì)菌用來抵御外來噬菌體、質(zhì)?；蚱渌苿釉秩镜墨@得性免疫防御體系［1-4］。CRISPR/Cas9屬于CRISPR/Cas蛋白家族中的Ⅱ型，構(gòu)成簡單，主要有Cas9蛋白、特異性CRISPR RNA（crRNA）及反式激活 crRNA（transactivating crRNA，tracrRNA）組成［5］。目前使用的 CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)是用人工設(shè)計的單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）對tracrRNA-crRNA復(fù)合物進行了替換，使該系統(tǒng)只包含sgRNA和Cas9核酸內(nèi)切酶2個元件［6］，使設(shè)計過程更加簡便。經(jīng)過人工改造后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其操作簡便、作用高效而廣泛應(yīng)用于基因治療、作物育種、疾病模型構(gòu)建及功能基因組研究等領(lǐng)域，成為最熱門的基因組編輯工具［7-11］。在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，sgRNA能與靶序列的堿基互補配對，Cas9蛋白作為核酸酶能切割雙鏈DNA，靶序列3′端的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adja?cent motif，PAM）為Cas9的DNA識別位點，sgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物后，通過sgRNA與靶序列的配對和Cas9蛋白對PAM的識別，該RNA-蛋白復(fù)合物精準(zhǔn)地靶向特異的DNA位點，激活Cas9的核酸酶活性，切割靶DNA，產(chǎn)生雙鏈斷裂（double strand breaks，DSB）［12-13］。DSB的產(chǎn)生將激活細(xì)胞內(nèi)部的DNA損傷修復(fù)機制，主要的修復(fù)機制有2種：同源重組（homology-directed repair，HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），以NHEJ為主，這會造成基因組編輯位點的堿基產(chǎn)生插入/缺失突變［14-16］。通過引入外源基因片段作為修復(fù)模板［17］和抑制NHEJ［18-20］雖可以提高HDR的編輯效率，但在靶位點精確矯正點突變，HDR的效率仍然較低（0.1%～5%）［13，21］。除此之外，由于DSB的產(chǎn)生，不可避免地激活細(xì)胞內(nèi)NHEJ修復(fù)機制，導(dǎo)致靶位點處出現(xiàn)非預(yù)期的堿基改變，而且該系統(tǒng)可能會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，在非靶位點誘發(fā)DSB而產(chǎn)生插入/缺失突變［15，22］。如何能在不產(chǎn)生DSB的情況下進行精確的基因組編輯成為亟待解決的技術(shù)難題。

1 單堿基基因編輯技術(shù)概況及其優(yōu)化

針對上述技術(shù)瓶頸，美國哈佛大學(xué)David LIU實驗室于2016年4月和2017年10月在Nature雜志上分別首次報道了基于CRISPR/Cas9的胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)［23］和新型腺嘌呤單堿基基因編輯技術(shù)［24］，該技術(shù)首次實現(xiàn)了不依賴DNA雙鏈斷裂而能夠?qū)NA 4種堿基A，T，G和C進行替換，開啟了單堿基基因組編輯的新紀(jì)元。

1.1 胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)

胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)能在一定的編輯窗口內(nèi)實現(xiàn)堿基C到T的單堿基轉(zhuǎn)換，也稱之為單堿基編輯器（base editor，BE）。David LIU實驗室共研發(fā)了4代BE系統(tǒng)，即BE1-BE4，其核心組成主要由sgRNA和Cas9蛋白和胞苷脫氨酶組成，其中Cas9蛋白和胞苷脫氨酶為融合蛋白。該系統(tǒng)中使用的胞苷脫氨酶有大鼠的APOBEC1、七鰓鰻來源的胞苷脫氨酶（petromyzon marinus cytidine deami?nase1，PmCDA1）以及人源的激活誘導(dǎo)性胞苷脫氨酶（activation induced cytidine deaminase，AID）；使用的Cas9蛋白來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenesCas9，SpCas9）和金黃色葡萄球菌（Staph?ylococcus aureusCas9，SaCas9）。SaCas9的BE系統(tǒng)習(xí)慣稱為SaBE，在單堿基基因編輯系統(tǒng)中Cas9蛋白使用的是Cas9突變體，即dCas9和Cas9n（D10A）。dCas9無核酸內(nèi)切酶活性，進行DNA編輯時不切割靶DNA，不會產(chǎn)生DNA斷裂，而Cas9n（D10A）是在dCas9的基礎(chǔ)上，恢復(fù)了其在HNH結(jié)構(gòu)域的催化堿基。因此，Cas9n（D10A）有單鏈DNA切口酶活性，在進行DNA編輯時會在1條DNA單鏈上切割而產(chǎn)生切口。由于Cas9n（D10A）和dCas9仍保持與sgRNA結(jié)合的能力，但均不會引起DSB，從而有效抑制了由NHEJ介導(dǎo)的插入/缺失突變的發(fā)生。BE進行基因編輯時，通過sgRNA與靶位點序列互補配對和Cas9蛋白對PAM的識別，融合蛋白結(jié)合并識別靶位點，胞苷脫氨酶能夠?qū)⒎腔パa鏈中編輯窗口內(nèi)的堿基C脫氨基而轉(zhuǎn)變?yōu)閴A基U，而U可以在隨后的復(fù)制過程中被DNA聚合酶識別為T，從而實現(xiàn)DNA中C→T（或者G→A）的轉(zhuǎn)變?；诖硕a(chǎn)生了第1代BE，即rAPO?BEC1-XTEN-dCas9。但EB1在細(xì)胞內(nèi)的編輯效率很低，僅0.8%～7.7%，比細(xì)胞外編輯效率降低了80%～97.2%，原因是細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機制影響了堿基編輯的U∶G配對產(chǎn)物。在細(xì)胞中，尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UDG）能催化U從DNA鏈上移除，并且啟動堿基切除修復(fù)（base-excision repair，BER）。通常修復(fù)的結(jié)果是將U∶G堿基修復(fù)為C∶G堿基，從而使得編輯效率大幅下降，這是第1代BE存在的主要問題。為了抑制UDG的作用，在Cas9蛋白和胞苷脫氨酶融合蛋白后又融合了尿嘧啶DNA糖基化酶抑制因子（uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI）。UGI是一種來自枯草芽孢桿菌噬菌體PBS2的含有83個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，可以抑制UDG活性，從而提高了BE的單堿基編輯效率。由此產(chǎn)生了BE2，即rAPO?BEC-XTEN-dCas9-UGI，BE2的編輯效率比BE1提高3倍，提高至20%。為了促進細(xì)胞內(nèi)啟動以編輯鏈為模板合成新DNA鏈的修復(fù)機制從而進一步提高編輯效率，研究者開發(fā)了第3代BE，即用Cas9n（D10A）替換了dCas9。Cas9n（D10A）可將包含G堿基的非編輯鏈（單鏈）切斷，通過誘導(dǎo)DNA錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR），使BE3 rAPO?BEC-XTEN-Cas9n-UGI的編輯效率提高至約37%且脫靶效率顯著下降，而且不同來源的胞嘧啶脫氨酶組成的BE3和使用SaCas9突變體的SaBE3同樣具有較高的編輯效率。雖然第3代單堿基編輯系統(tǒng)的編輯效果得到很大改善，但編輯的產(chǎn)物純度仍不盡人意，即C∶G堿基對不僅會被編輯成T∶A，同時也會被編輯成G∶C或者A∶T。這種情況在編輯窗口中只存在一個堿基C時更加明顯，這主要是由于UDG和DNA無嘌呤或無嘧啶位點（apurinic or apyrimidinic site，AP）裂合酶的作用導(dǎo)致的。AP裂合酶是一種BER酶，可以將AP轉(zhuǎn)變成單鏈DNA缺口。由于UDG催化U從DNA鏈上移除將會造成AP位點，被AP裂合酶識別從而斷裂DNA，加之Cas9n（D10A）將包含G堿基的非編輯鏈（單鏈）切斷，從而造成DSB，造成細(xì)胞的錯誤修復(fù)。為了進一步減少UDG對堿基U的接觸，研究者將UGI增加到2個拷貝，即成為rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI-UGI，稱為第4代BE。BE4比BE3 rAPOBECXTEN-Cas9n-UGI的編輯效率提高約1.5倍，非T產(chǎn)物降低約52.2%，插入/缺失突變率降低約52.2%，顯著提高了編輯產(chǎn)物的純度和編輯效率。由于UDG和AP裂合酶的作用能產(chǎn)生DSB，在BE3和BE4的產(chǎn)物中也存在一定的插入/缺失突變。一種來自噬菌體Mu的蛋白質(zhì)Gam可以結(jié)合在DSB位點的末端起到保護作用，所以研究者在BE3，SaBE3，BE4和SaBE4中融入Gam蛋白，均有效降低了插入/缺失突變的發(fā)生［23，25-27］。

除David LIU實驗室之外，日本神戶大學(xué)Akihiko Kondo實驗室于2016年8月在Science雜志上也報道了胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)［28］。該實驗室將七鰓鰻的胞苷脫氨酶與SpCas9的突變體和UGI融合，開發(fā)了dCas9-PmCDA1-UGI和Cas9n-PmCDA1-UGI單堿基基因編輯系統(tǒng)。同年10月，上海交通大學(xué)常興課題組［29］把核酸酶缺陷的Cas9蛋白和誘導(dǎo)抗體高頻突變的人胞苷脫氨酶AID融合，開發(fā)了dCas9-AIDx單堿基編輯系統(tǒng)：在一種UDG抑制因子的輔助下，dCas9-AIDx可以誘導(dǎo)特定的堿基C向T轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)單堿基的精準(zhǔn)編輯。隨后報道的CRISPR-X也使用了dCas9和AID突變體，與常興課題組的單堿基編輯系統(tǒng)有相似作用［30］。

1.2 腺嘌呤單堿基基因編輯技術(shù)

胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)能利用胞苷脫氨酶將C∶G堿基對轉(zhuǎn)換成T∶A堿基對，如果將胞苷脫氨酶換成腺苷脫氨酶，理論上可以實現(xiàn)A∶T堿基對轉(zhuǎn)換成G：C堿基對。但是，已發(fā)現(xiàn)的天然腺苷脫氨酶，比如大腸桿菌的TadA［31-32］、人ADAR2［33］、小鼠ADA［34］和人 ADAT2［35］，僅作用于游離的腺嘌呤、腺苷、RNA中的腺苷或者錯配的RNA∶DNA異聚體，不能催化DNA鏈上的堿基A脫氨基［36］。因此，人工創(chuàng)造出能催化DNA鏈上的A堿基脫氨基成為此技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

David LIU實驗室率先實現(xiàn)了上述突破，他們選擇與APOBEC酶同源的大腸桿菌TadA酶作為改造對象。該酶作用于tRNA單鏈反密碼子環(huán)，無需小分子激活劑即能催化tRNA上的堿基A脫氨基。將該酶與dCas9融合構(gòu)建了TadA-dCas9的隨機突變（突變位點在TadA）質(zhì)粒文庫，將細(xì)菌中抗生素抗性基因的關(guān)鍵位點突變成A∶T從而使抗性失效，細(xì)菌在抗生素環(huán)境中無法存活。只有具備DNA堿基編輯能力的突變TadA-dCas9的存在，在sgRNA的引導(dǎo)下，將突變的A∶T修復(fù)成G∶C后才能使細(xì)菌重新獲得抗性而存活。通過細(xì)菌對TadA酶的定向進化和蛋白質(zhì)工程手段，經(jīng)過7輪選擇優(yōu)化，David LIU實驗室成功獲得了將A∶T堿基對轉(zhuǎn)換成G∶C堿基對的腺嘌呤單堿基編輯器（adenine base editor，ABE），其中ABE7.10的編輯效率達到（58±4.0）%［24］。

ABE系統(tǒng)能將編輯窗口內(nèi)的A堿基脫氨基而轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤?，肌苷被?dāng)成G進行讀碼與復(fù)制，從而實現(xiàn)編輯窗口內(nèi)A到G的突變。ABE7.10的編輯窗口大概包含4～6個核苷酸，目標(biāo)堿基A在原型間隔序列（protospacer）上第4～7堿基位置，PAM在第21～23堿基位置。將檢測目標(biāo)DNA位點由6個增加到17個，ABE7.10的編輯效率仍然達到（53±3.7）%，顯著高于經(jīng)典BE3對C∶G至 T∶A的編輯效率［1］，具有更低的靶位點非A→G突變和插入/缺失突變的產(chǎn)生（≤0.1%），而且脫靶率也很低［24］。

中國科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心的朱健康研究團隊［37］使用SaCas9與突變的TadA酶融合，開發(fā)了ABEP2，在某些位點的編輯效率可達61.3%，而且精確性也很高。

1.3 單堿基基因編輯技術(shù)的優(yōu)化

BE系統(tǒng)中胞苷脫氨酶rAPOBEC1的活性窗口有大概含5個核苷酸，目標(biāo)堿基C在原型間隔序列上第4～8堿基的位置。常用的SpCas9的PAM NGG在第21～23堿基的位置，編輯窗口內(nèi)的全部堿基C都有可能被編輯［23，27］，這樣就會導(dǎo)致活性窗口中非目標(biāo)的堿基C也會發(fā)生替換作用。而且因為大多數(shù)位點在靶點堿基下游缺少PAM序列，PAM NGG序列的要求限制了單堿基基因編輯系統(tǒng)可以編輯的基因組位點。因此，縮小編輯窗口或擴大PAM識別序列類型成為亟待解決的問題。

鑒于上述問題，David LIU實驗室通過多種嘗試，發(fā)現(xiàn)對胞苷脫氨酶進行突變，可以縮小編輯窗口。他們針對rAPOBEC1的催化位點W90及結(jié)合位點R126和R132進行突變檢測，發(fā)現(xiàn)W90Y，W90F，R126A，R126E和R132E突變均可縮小活性窗口。將這3個突變位點進行組合突變，篩選出了可以進一步縮小編輯窗口，提高編輯精準(zhǔn)性的優(yōu)化編輯器：YE1-BE3（W90Y+R132E），YE2-BE3（W90Y+R126E），EE-BE3（R126E+R132E）和YEE-BE3（W90Y+R126E+R132E）。前3個編輯器的編輯窗口約2個堿基，編輯效率與BE3相似。YEE-BE3在平均編輯效率只降低了96.6%的情況下，將編輯窗口精確到了1個堿基C，大大提高了編輯的精準(zhǔn)性。在包含多個C堿基的BE3編輯窗口內(nèi)，這些優(yōu)化的編輯器具有編輯位置偏好性，一般是C5＞C6＞C7≈C4［38］。

目前，常用的SpCas9蛋白識別的PAM一般是NGG，SaCas9蛋白識別的PAM是NNGRRT，這在傳統(tǒng)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用中也受到限制。為了擴大CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的靶向范圍，多個實驗室對Cas9蛋白進行了突變篩選，得到了許多優(yōu)化突變體［39-40］。為了擴大單堿基基因編輯系統(tǒng)可編輯的基因組位點，David LIU實驗室將優(yōu)化的Cas9突變體代替BE3和SaBE3中相應(yīng)的Cas9蛋白，獲得了優(yōu)化的單堿基編輯器：VQRBE3，EQR-BE3，VRER-BE3 和SaKKH-BE3。他們識別的PAM分別是NGAN，NGAG，NGCG和NNNRRT，而且VQR-BE3和EQR-BE3的脫靶率更低［38］。

當(dāng)然，上述對PAM識別的擴展對于龐大的基因組編輯來講是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。2018年2月，David Liu實驗室在Nature上發(fā)表了新的研究成果，極大地拓寬了基因編輯的應(yīng)用范圍［41-42］。該團隊利用噬菌體輔助持續(xù)進化（phage-assisted continuous evolu?tion，PACE）的定向進化技術(shù)，基于SpCas9開發(fā)出了新型基因編輯工具酶——xCas9。其中的xCas9 3.7除了能夠識別NGG PAM之外，對于NG，NNG，GAA，GAT及CAA這些PAM序列也能夠識別。將xCas9 3.7替換BE3和ABE7.10中的SpCas9，構(gòu)建 xCas9（3.7）-BE3 和 xCas9（3.7）-ABE單堿基編輯器。研究發(fā)現(xiàn)，在NGG PAM位點，xCas9（3.7）-BE3編輯效率為（37±10）%，而SpCas9-BE3的編輯效率為（28±5.2）%；在NGT，NGA和NGC PAM位點，xCas9（3.7）-BE3編輯效率分別為SpCas9-BE3的9.5，3.5和13倍；而在GAA 和GAT PAM位點，xCas9（3.7）-BE3編輯效率分別是SpCas9-BE3的50倍以上和100倍以上；xCas9（3.7）-ABE的編輯效率同樣高于SpCas9-ABE，在NGG PAM位點，xCas9（3.7）-ABE編輯效率為（69±3.7）%，而SpCas9-ABE的編輯效率為（48±2.1）%；在GAT PAM位點，xCas9（3.7）-ABE編輯效率為（16±1.5）%，而SpCas9-ABE未檢測到編輯（≤0.1%）；在NGC和NGA PAM位點，xCas9（3.7）-ABE編輯效率分別為（21±2.5）%和（43±1.5）%，而SpCas9-ABE的編輯效率分別為（7.0±1.3）%和（22±1.2）%。xCas9 3.7脫靶率很低，xCas9 3.7的PAM序列識別靈活性、酶活性和保真性同時得到優(yōu)化的機制尚不明確。

除了上述對單堿基基因編輯系統(tǒng)的優(yōu)化，國內(nèi)外的很多研究團隊在其他方面也進行了積極的探索，提高了單堿基編輯系統(tǒng)的精確性［43-45］。

2 單堿基基因編輯技術(shù)在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

單堿基基因編輯技術(shù)自首次報道至今，已經(jīng)在疾病治療、動物疾病模型制作和藥物篩選等方面得到了廣泛的應(yīng)用，取得了較好的編輯效果。

人類遺傳疾病中，約2/3是由單堿基突變造成的。在人類單堿基突變相關(guān)的疾病中，由C∶G突變?yōu)門∶A導(dǎo)致的疾病占48%，由A∶T突變?yōu)镚∶C導(dǎo)致的占疾病14%［24］。單堿基基因編輯技術(shù)為這些疾病的治療提供了有力的支持。PCSK9是高膽固醇血癥的重要靶點，PCSK9敲除可顯著降低血液中低密度脂蛋白膽固醇水平［46］。Chadwick等［47］將可導(dǎo)致PCSK9基因無義突變的BE系統(tǒng)導(dǎo)入成年小鼠的肝中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血液中PCSK9蛋白表達水平大幅下降（＞50%），膽固醇水平降低約30%，而且未檢測到脫靶。HBB-28（A＞G）突變是中國及東南亞β-地中海貧血病患者的主要致病因素。中山大學(xué)黃軍就課題組采集HBB-28（A＞G）純合體患者的血液細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞，通過核移植技術(shù)構(gòu)建突變胚胎，將BE3和sgRNA注射到核移植胚胎中，胚胎的基因修正效率超過了23%，證實了單堿基基因編輯系統(tǒng)可以針對單堿基突變的人類胚胎基因組進行精確的修復(fù)，為點突變遺傳性疾病的治療具有重要的臨床前研究意義［48］。

韓國首爾大學(xué)Jin-Soo Kim研究團隊率先利用BE系統(tǒng)進行了動物疾病模型的制備，他們將BE3的mRNA或融合蛋白與靶向抗肌萎縮蛋白基因Dmd以及酪氨酸酶基因tyr的sgRNA，通過電轉(zhuǎn)染或顯微注射方式導(dǎo)入小鼠的受精卵［49］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靶向Dmd基因的F0代小鼠（9只）中，約50%發(fā)生無義突變，其中1只是純合子突變小鼠，在靶向Tyr基因的F0代小鼠（7只）中，基因編輯效率達100%，其中3只是純合子突變小鼠。利用BE3在非洲爪蟾的早期胚胎中對tyr基因進行單堿基基因編輯，編輯效率為20.5%，且無脫靶突變，這表明單堿基基因編輯技術(shù)是建立非洲爪蟾人類點突變疾病模型的有力工具［50］。在兔的疾病模型中，用BE3和ABE7.10系統(tǒng)在囊胚和F0代分別可以實現(xiàn)53%～88%和44%～100%的靶向突變效率，通過有效誘導(dǎo)無義突變和錯義突變，單堿基基因編輯技術(shù)在兔子中可以準(zhǔn)確模擬人類此類疾病發(fā)病過程［51］。

上海交通大學(xué)常興課題組研發(fā)了dCas9-AIDx單堿基編輯系統(tǒng)，其靶向性AID介導(dǎo)的堿基突變發(fā)生（targeted AID-mediated mutagenesis，TAM）技術(shù)可以將細(xì)胞內(nèi)的特定DNA序列多樣化，從而進行高通量功能獲得性單堿基突變篩選。這一方法可以有效且迅速地模擬腫瘤細(xì)胞體內(nèi)耐藥機制的異質(zhì)性，從而進行腫瘤耐藥突變的篩選。該課題組用dCas9-AIDx在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中編輯BCR-ABL，有效鑒定了慢性髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞中對伊馬替尼（imatinib）抗性的已知突變和新突變［29］。斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)系和藥理學(xué)系的研究者報道的CRISPR-X也使用了dCas9和AID突變體，以及攜帶MS2修飾sgRNA，可以同時靶向多個基因組位點。研究者利用CRISPR-X突變了癌癥治療藥物硼波替單抗（替佐米，bortezomib）的靶點——PSMB5，結(jié)果從中鑒定了引發(fā)波替單抗耐藥性的已知和全新的突變［30］。由于耐藥金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，迫切需要新的治療金黃色葡萄球菌感染的治療手段，研究者利用Cas9n（D10A）和APOBEC1融合形成單堿基編輯系統(tǒng)pnCasSA-BEC，能夠高效地使金黃色葡萄球菌發(fā)生點突變和基因失活，該系統(tǒng)的發(fā)展將極大地加速金黃色葡萄球菌藥物靶點的研發(fā)［52］。

3 單堿基基因編輯技術(shù)存在的主要問題

相對于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，單堿基基因編輯技術(shù)對于基因組單堿基位點具有更高的編輯效率、更高的精確度和更低的脫靶率，由于不引入DSB，插入/缺失突變的發(fā)生率更低。因此，單堿基編輯技術(shù)成為生命科學(xué)領(lǐng)域全球研究的熱點。然而，目前所使用的單堿基編輯工具還存在著一些不足。

3.1 堿基轉(zhuǎn)換的局限性

人類單堿基突變相關(guān)的疾病中，還存在G∶C突變?yōu)镃∶G（占11%），T∶A突變?yōu)锳∶T（占7%），A∶T突變?yōu)镃∶G（占6%）和C∶G突變?yōu)锳∶T（占15%）的疾?。?4］，但目前的DNA單堿基基因編輯技術(shù)無法進行修正。因此，還需要進一步開發(fā)針對各種單堿基突變類型的單堿基編輯工具。

3.2 堿基編輯的安全性

雖然有研究驗證了單堿基基因編輯技術(shù)在全基因組水平上的準(zhǔn)確性［53］，但仍然存在安全風(fēng)險。主要表現(xiàn)在：①靶位點會產(chǎn)生C到非T或A到非G的轉(zhuǎn)換；②編輯窗口內(nèi)非目標(biāo)C或A堿基的編輯；③靶位點仍會產(chǎn)生極少量的插入/缺失突變；④脫靶效應(yīng)雖然低，但仍然存在；⑤胞苷脫氨酶和優(yōu)化的大腸桿菌TadA酶，都具有結(jié)合DNA進行脫氨基的作用，如果脫氨酶的表達量過高，可能會對基因組的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響。

3.3 PAM識別序列的限制

雖然xCas9極大拓寬了基因編輯的應(yīng)用范圍，但也只能夠直接靶向1/4人類基因組序列［41］，而且David LIU實驗室僅在基因組的幾十個位點上進行了測試，現(xiàn)在還不能100%確定xCas9將比SpCas9更好，還需更多的實驗驗證。

3.4 在體基因治療的可行性

單堿基基因編輯技術(shù)是將Cas9和胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶以及UGI等形成融合蛋白來行使作用，用得較多的是SpCas9，這使其序列組成比較長，如果用常用的基因治療載體——腺相關(guān)病毒進行轉(zhuǎn)染，則腺相關(guān)病毒的包裝容量限制了該技術(shù)的應(yīng)用。SaCas9的編碼序列比SpCas9要小23%，這一大小差異使得SaCas9適于以病毒為載體的基因治療［54］。但是，SaCas9的PAM特異性又限制了編輯范圍，或許也可通過定向進化技術(shù)，像改造SpCas9那樣來改造SaCas9的PAM特異性。如果不使用病毒載體，則需要積極探索其他途徑，比如基于金納米簇的納米遞送體系［55］，以期開發(fā)出更加安全高效的方法。